高温胁迫下柠条抗氧化系统的响应

李 玉，王 杰，权 丽*，向 玫

1.甘肃省白龙江林业管理局林业科学研究所，甘肃 兰州 730046； 2.甘肃白龙江森林生态系统国家定位观测研究站，甘肃 舟曲 746300

近年来有关高温胁迫对植物伤害的研究表明,高温引起植物体内活性氧水平升高,从而直接或间接启动膜脂过氧化作用,导致膜伤害和破坏,严重时造成细胞死亡[1]。植物内源保护系统的抗氧化能力及生物膜的稳定性是决定植物对逆境胁迫响应特征的关键因素[2]。大量研究证实,植物在高温胁迫下体内活性氧积累超过正常水平，超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化物酶( POD) 等抗氧化酶由于底物浓度增加而被诱导合成,用以抵御和清除活性氧，防止膜脂过氧化，增强植物的自我保护能力[3]。许多研究表明,高温首先破坏细胞膜结构, 致使细胞内溶物外渗,细胞膜的热稳定性即高温胁迫下细胞的电导率直接反映植物的耐热程度[4]；膜酯过氧化作用是导致膜结构破坏,引起植株损伤甚至死亡的重要原因, 植物体内过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等细胞膜保护酶与植物的耐热性有关,可以作为耐热性筛选指标[5]。另有研究指出,植物体内脯氨酸水平与抗逆性有关[6]。柠条是黄土高原地区重要的灌木树种，具有广泛的适应性和很强的抗逆性，是营造水土保持林、防风固沙林、薪炭林和饲料林的优良树种[7]。目前,有关柠条热适应机理研究报道很少，本研究对柠条枝条进行了高温胁迫，通过测定不同温度处理下柠条的相关抗氧化指标，研究柠条抗氧化系统对高温逆境的响应,以揭示柠条的抗氧化保护特性和机制。

1 材料与方法

1.1 样地概况

兰州市北山的九州台，地理位置为35°58′54″～36°11′20″N，103°12′47″～103°58′09″E ，海拔2066. 8 m。该地区属于黄土高原半干旱地区，土壤为黄土母质上发育起来的灰钙土，有机质含量0.5%～1.5%左右，pH 8～9。气候干燥少雨,年均降水在320 mm左右,年平均蒸发量 1 468 mm，是降水量的4.4倍, 年平均日照时数 2 607.6 h；无霜期185 d～200 d；年平均风速仅为0.94 m·s-1，坡度22°～43°[8]。土壤以淡灰钙土为主，颗粒较粗，沟坡分布有红胶泥和红沙土，pH值8.0～9.0[9]。受水分条件制约，该区自然植被生长稀疏,主要物种有荒漠锦鸡儿(Caraganaroborovskyi.)、芨芨草(Ach-natherumsplendens)、红砂等。人工栽培植物种主要以柠条(Caraganakorshinkii)、白刺(Nitrariasibirica)、紫穗槐(Amorphafruticosa)、柽柳(Tamarixaustrongolica)、刺槐(Robiniapsrudoacia.)、油松(Pinustabulaeformis)等为主。

1.2 材料及处理

在兰州市北山的九州台,选取在同一地点,生长良好的柠条植株，采种时间段为早晨9:00～10:00,将采好的柠条枝条快速处理后,放入冰盒中,带回实验室,将柠条枝条浸泡在水中，以室温为对照，在人工气候箱内，设定30℃、35℃、40℃、45℃为高温处理温度，分别处理2h后,采集叶片进行生理指标的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 丙二醛含量的测定

MDA含量测定采用TBA法[10]，取0.5 g植物样品(叶)，加5 mL5%TCA，研磨后所得匀浆在 3 000 r·min-1下离心10 min。取上清液2 mL，加2 mL0.67%TBA，混合后在100℃水浴上煮沸30 min，冷却后再离心一次。分别测定上清液在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值，按下式计算MDA的含量：

C/μmol/L=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450

式中OD532、OD600、OD450分别代表450 nm、532 nm和600 nm波长下的吸光度值。

1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)酶活性测定

0.5 g鲜材料加0.05 mol·L-1(pH7.8)磷酸缓冲液研磨,匀浆在 1 000 r·min-1冷冻离心20 min,取上清液进行酶活性测定。

SOD活性测定参照邹琦的方法[11]。取3支试管，1支为遮光对照管，1支为照光对照管，剩余1支为测试管。分别加入1.5 ml0.05 mol·L-1(pH值7.8)磷酸缓冲液，0.3 ml130 mmol·L-1甲硫氨酸，0.3 ml750 μmol·L-1NBT，0.3 ml100 mmol·L-1EDTA-Na2，0.3 ml 20 μmol·L-1核黄素，0.5 ml蒸馏水。两支对照管加入0.05 ml(pH值7.8)磷酸缓冲液，测试管中加0.05 ml酶提取液，立即对遮光对照管遮光处理，将照光对照管，测试管轻轻摇匀，在 4 000 lx下照光30 min 进行光化还原。以遮光对照管为对照，测定其它两管的OD560。重复3次。已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性=((ACK-AE)×V)/(1/2×ACK×W×Vt)

式中:SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；ACK为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度:V为样品液总体积,ml；Vt为测定时样品用量,ml；W为样鲜重,g。

1.3.3 过氧化物酶(POD)活性的测定

采用愈创木酚法测定POD活性[12]。称取0.3g新鲜材料，放入预冷研钵中，加5ml(pH=6.5)磷酸缓冲液冰浴下研磨成浆。将匀浆全部转入离心管，于 3 000 r·min-1冷冻离心10 min，上清液为POD粗酶液，低温保存。

配H2O2，蒸馏水调零(对照)，向比色杯中加0.1 ml测定液，2.6 ml0.3%愈创木酚，将比色杯放入比色槽，加0.3 ml0.6% H2O2，立即开始计时启动反应，自动计时设2 min,波长为470 nm,记录470 nm下2 min内的吸光度值的变化。重复3次。结果计算，以每分钟内△OD470增加1为1个酶活性单位：

POD活性=[(△OD470/min×提取液总体积)/测定时用酶液体积]/取样质量

1.3.4 抗坏血酸(ASA)含量的测定

利用比色法进行测定[13]，取0.25 g鲜叶+1.5 ml2%草酸，研磨匀浆，加少许1%草酸，转入25 ml容量瓶，用1%草酸冲洗研钵数次，再给上述溶液中加入0.25 ml 30%硫酸锌，摇动，再加0.25 ml 15%亚铁氰化钠，用1%草酸定容至25 ml,抽虑，滤液为待测液。经过测定绘制出标准曲线，从标准曲线上查AsA含量。用如下公式计算AsA含量：

AsA含量(mg/gFW)=[(查得的AsA含量×提取液总体积/测定用的体积)/1 000]/样重=[(查得的AsA含量×50/4)/1 000] /0.5=查得的AsA含量×25/1 000

1.3.5 柠条叶片中脯氨酸含量的测定

参照李合生的方法，采用茚三酮比色法测定[10]。称取待测植物叶片0.25 g，加入5 mL3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10 min，吸取2 mL提取液加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30 min，溶液即呈红色。然后加入4 mL甲苯，摇荡30 s，静置片刻，取上层液至10 mL离心管中，在 3 000 r·min-1下离心5 min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520 nm波长处比色，求得吸光度值。根据回归方程计算出(从标准曲线上查出)2 ml测定液中脯氨酸的浓度(μg·mL-1)，根据公式计算出脯氨酸含量(μg·g-1)。计算公式为：

脯氨酸含量=(X×5/2)/(鲜样重)。

式中：X为测定液中脯氨酸的浓度。

1.3.6 数据处理

采用Excel和SPSS17.0进行统计分析，采用单因素方差分析(one-Way ANOVA)检验数据的显著性差异(P<0.01)。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫下柠条叶片MDA含量的变化

丙二醛(MDA)是膜质过氧化作用的主要产物之一，也是细胞膜被破坏的标志物质[14]。其含量可以表示膜脂过氧化的程度和植物对逆境条件反映的强弱[15]。膜脂过氧化是高温对植物细胞膜造成伤害的原初机制，高温导致叶片细胞膜脂过氧化增强。

图1表明，随着高温胁迫的加剧，MDA含量持续增加，膜脂过氧化程度加剧, 30℃、35℃、40℃、45℃处理的MDA含量分别是对照的1.12倍、1.40倍、1.58倍和1.68 倍。

图1 不同温度胁迫下柠条叶片内MDA含量的变化

表1 MDA单因子方差分析表

经方差分析，由表1知各高温胁迫处理的MDA与对照值相比，P=0.000，P<0.01,差异均达极显著水平。说明短时间的高温胁迫促进了植物MDA含量的持续积累，细胞表面膜质过氧化程度加强，这和尹坚贵等[16]的结论相同。

2.2 高温胁迫对柠条叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

SOD是植物体内清除活性氧自由基的关键酶，在保护细胞免受氧化损伤过程中具有十分重要的作用[17]。

由图2可以看出，随处理温度的升高，柠条叶片的SOD活性迅速上升，35℃时达最大值，而后呈下降趋势。表2可知各处理柠条SOD活性均与对照存在极显著差异( P<0.01)。说明柠条SOD酶对逆境能做出快速反应，但当胁迫增加到一定程度时，活性开始持续下降。

图2 不同温度胁迫下柠条叶片内SOD活性的变化

表2 SOD单因子方差分析表

2.3 高温胁迫对柠条叶片过氧化物酶(POD)活性的影响

POD是植物对膜脂过氧化的酶促防御系统中重要的保护酶，POD在保护酶系统中主要是起到酶促降解H2O2的作用，从而使植物抵抗在逆境胁迫下代谢过程产生的有害物质对细胞的伤害，表现出一定的抗逆性，其酶活性与植物抗旱性呈一定的相关性[18]。多数人已研究表明，抗旱性强的植物在高温胁迫下，POD保护酶系统仍能维持较高的活性水平，防止了因高温产生的毒害物质如活性氧自由基的积累，减轻了由膜脂过氧化所引起的膜伤害，从而增加了植物的抗旱能力[19]。

由图3可以看出，随着高温胁迫强度的增加，柠条叶片的POD活性呈先升后降的变化趋势。 30℃、35℃、40℃和45℃处理下的POD活性依次比对照增加1.96倍、3.82倍、2.11倍、1.47倍。

图3 不同温度胁迫下柠条叶片内POD活性的变化

表3 POD单因子方差分析表

经方差分析得出，各高温处理与对照之间的POD活性差异均达极显著水平( P<0.01) 。POD的增加可能是活性氧在短时间内作为信号分子诱导酶活性的增高，但随着处理程度的加剧，POD活性明显下降，可能是高温胁迫使活性氧的大量积累，超出了POD保护酶的清除能力。

2.4 高温胁迫下柠条叶片抗坏血酸(ASA)含量的变化

由图4可见，随着温度胁迫程度加重，柠条ASA的含量呈上升趋势，45℃处理下ASA含量最高，约为对照的3.5倍。

图4 不同温度胁迫下柠条叶片内ASA含量的变化

表4 POD单因子方差分析表

经方差分析，高温胁迫处理的ASA含量均与对照存在极显著差异( P<0.01)，柠条在严重高温胁迫下具有较高的ASA含量，说明ASA对减缓和抵御活性氧的伤害具有重要意义。

2.5 高温胁迫下柠条叶片脯氨酸含量的变化

脯氨酸主要是以游离状态广泛存在于植物中, 它是水溶性最大的氨基酸, 具有较强的水合能力[22]。逆境胁迫下植物体内游离脯氨酸积累是一个普遍现象。脯氨酸含量的大幅增加有利于水分的保持,从而减轻由于高温引起蒸腾作用加剧而产生的伤害[[23]。脯氨酸在胁迫条件下可以调节渗透平衡, 维持蛋白质、膜和亚细胞结构的稳定, 清除活性氧。

图5表明，随着高温胁迫程度的加剧，脯氨酸含量持续增加，30℃、35℃、40℃和45℃处理脯氨酸含量依次比对照增加4.01倍、3.5倍、3倍、2倍。

图5 不同温度胁迫下柠条叶片内脯氨酸含量的变化

表5 脯氨酸含量单因子方差分析表

经方差分析，在不同程度的高温胁迫处理下，P=0.02，柠条叶片脯氨酸的积累量均极显著地高于对照(p<0.01)，且各高温胁迫处理间的脯氨酸含量的差异也达到了极显著水平(p<0.01)。说明脯氨酸的积累是柠条适应高温胁迫的一种重要机制。

3 结论与讨论

在高温的自然环境下，植物的生长发育经常会受到高温胁迫的影响。植物为了逃避或者抵抗这种高温胁迫的伤害，激起或者提高了植物体内清除活性氧、保护膜系统的抗氧化防御系统的活性[24]。该系统主要由抗氧化酶类和抗氧化剂类组成，前者包括过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶等，统称为细胞的保护酶系统；后者则包括α维生素E、抗坏血酸、谷胱甘肽、类胡萝卜素、脯氨酸等。

当植物处于逆境胁迫时，细胞内氧自由基产生和清除的平衡会遭到破坏，积累的氧自由基首先攻击膜系统，膜脂脂肪酸中的不饱和键被过氧化，最终形成 MDA。逆境条件下，细胞膜膜脂过氧化作用的增强是膜伤害的重要原因之一。高温胁迫下，柠条叶片内MDA含量持续增加，说明高温使柠条膜质过氧化水平加重，细胞膜系统结构在一定程度上遭到破坏，高温胁迫程度与MDA增加程度具一定相关性[25]。

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