条件性胰岛β细胞DEPTOR 基因敲除小鼠构建及鉴定

赖舒畅 邱鸿 王肖 潘道延 王桢钰 李凯 白晓春 沈洁

1南方医科大学第三附属医院内分泌科（广州 510515）；2南方医科大学第三附属医院医学实验研究中心（广州 510515）；3广州中医药大学经济与管理学院（广州 510515）

糖尿病的病因十分复杂，遗传、环境、行为等多种因素共同参与、相互作用而导致糖尿病的发生。全球的糖尿病患者超过4.15亿，预计到2040年前，全球将有6.42亿糖尿病患者，这将给个人及社会带来严重的经济负担［1］。

哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种高度保守的丝氨酸-苏氨酸类激酶，通过在体内形成两种不同的复合体对机体生长、代谢产生调控作用。mTOR与肥胖、糖尿病等代谢性疾病关系密切，在胰岛素信号通路，胰岛β细胞生长、发育、增殖以及调控代谢调节激素的合成分泌等多种途径中发挥重要作用［2-3］。DEPTOR 是 2009 年，PETERSON 等［4］发现一类新的mTOR结合蛋白，能够负性调节mTORC1和mTORC2的活性。尽管许多体外实验已经证实DEPTOR负性调控mTOR的作用，DEPTOR在体内的作用仍然很少被了解。近年来研究发现，DEP⁃TOR对细胞代谢也有着重要的影响。然而，目前对DEPTOR在代谢中作用的研究多数集中在细胞和分子水平，为进一步了解DEPTOR的作用，本课题组根据国际上常用的Cre/loxp系统原理，利用DEPTORloxp/loxp小鼠和胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶小鼠Ins1⁃Cre/ERT小鼠，成功构建并鉴定了可诱导性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，为在整体动物水平研究DEPTOR基因在胰岛β细胞中的作用及糖尿病的发病机制提供了研究平台。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 鼠尾基因组DNA裂解液（A/B液）南方医科大学第三附属医院中心实验室配制：A液（0.5%SDS、0.1M NaCl、0.05M EDTA、0.01M Tris.C1 pH8.0、100 μg/mL蛋白酶K），B液（NAOH 1 mmol/mL）；DNA Marker（Gen Star，Lot#6BB02）、琼脂糖（BIOFROXX）购自广州斯佳生物有限公司；EB替代物（GR501⁃01）、PCRmix（P212⁃02）南京诺唯赞生物科技有限公司；PCR、QPCR引物均为上海生物工程有限公司合成；DEPTOR一抗、荧光二抗（Abcam）购自广州新晋生物有限公司；Insulin一抗（santa cruz），DAPI（invitrogen）购自广州杰特伟生物科技有限公司；其他常用试剂：EDTA、Tris碱、盐酸、氢氧化钠、等均为国产分析纯。

1.2 实验动物

1.2.1 条件性胰岛β细胞特异表达Cre重组酶小鼠 B6.Cg⁃Tg（Ins1⁃cre/ERT）1Lphi/J小鼠（JAX#024709，以下简称Cre小鼠）由上海茂生生物有限公司代理从美国JACKSON实验室引进。

1.2.2 DEPTORloxp/loxp小鼠DEPTORtm1a（EUCOMM）

Wtsi克隆胚胎干细胞EPD0556_1_H09购自欧洲突变小鼠资源库（EUCOMM ID：41725，德国），种系传播嵌合小鼠由上海南方模式生物中心构建。野生型（C57BL/6）小鼠购自南方医科大学实验动物中心。

1.2.3 两种基因小鼠的饲养和繁殖 将小鼠置于洁净的层流动物房内，室内温度控制在20～25℃，湿度控制在40%～70%，12 h光照，昼夜交替。DEPTORloxp/loxp采用雌雄均为DEPTORloxp/loxp的纯合子进行交配繁殖，Cre小鼠采用Cre重组酶杂合子（Cre+/-）和野生型小鼠进行交配繁殖。动物实验经过南方医科大学伦理委员会审核。

1.2.4 条件性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠的构建流程 基于Cre/loxp系统原理，构建流程如下：DEPTORloxp/loxp小鼠与Cre+/-小鼠交配，得到F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-小鼠。获得的F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-小鼠再与DEPTORloxp/loxp小鼠交配，得到DEP⁃TORloxp/lox.Cre+/-小鼠。DEPTORloxp/lox.Cre+/-基因型小鼠即为本实验所要构建模型小鼠的基因型。在小鼠胰岛β细胞中，胰岛素与外源性他莫昔芬同时作用下可诱导Cre重组酶表达，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列。因此通过控制外源性注射他莫昔芬时间可获得不同周龄胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠。

1.3 小鼠基因型鉴定

1.3.1 小鼠组织DNA提取 于3～4周龄时候剪取小鼠鼠尾约2 mm，并置于1.5 mL EP管中。加入100 μL鼠尾裂解液A液，100℃金属浴加热1 h；4 000转离心5 min，吸取上清移入新的EP管中；加入鼠尾裂解液B液100 μL，振荡混匀，制得DNA模板于-20℃保存备用。

1.3.2 PCR反应及琼脂糖电泳和成像分析 利用DEPTOR基因和Cre基因的鼠特异性引物（表1A）进行PCR反应。DEPTOR基因PCR反应体系（20 μL）：Pcrmix 10 μL，引物各 2 μL（引物浓度为 10 μm），模板DNA 2 μL，加灭菌蒸馏水补足体积。反应条件为94℃预变性3 min，94℃变性30 s、57℃退火1 min、72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸2 min，4℃保存备用。Cre基因PCR反应体系（20 μL）：Pcrmix 10 μL，目的基因引物2 μL（引物浓度为10 μm）和内参引物1 μL（引物浓度为10 μm），模板DNA 2 μL，加灭菌蒸馏水补足体积。反应条件为第一阶段94℃预变性2 min，94℃变性20 s、65℃退火15 s、68℃延伸10 s，10个循环；第二阶段94℃变性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸10 s，10个循环；第三阶段72℃延伸2 min，10℃保存备用。两种基因PCR反应终产物（6 μL/孔）进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析结果。

1.4 胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠敲除效果验证 对8周龄目的基因鼠（KO）和对照组鼠（Control）连续腹腔注射他莫昔芬（50 mg/kg）1周，于第12周时处死小鼠，取小鼠一部分胰腺组织提取RNA和总蛋白，剩余胰腺组织制成石蜡切片。按照常规QPCR、Western blot、免疫荧光步骤进行DEPTOR基因敲除效果的验证。

2 结果

2.1 DEPTORloxp/loxp、Cre+/-和 DEPTORloxp/loxpCre+/-小鼠繁殖及鉴定情况 DEPTORloxp/loxp小鼠纯合子自交繁殖，依据遗传定律，其子代小鼠的基因型均DEPTORloxp/loxp纯合小鼠，从引进开始繁殖10个月，共繁殖34只DEPTORloxp/loxp纯合小鼠，子代小鼠皮肤及毛发均为黑色，部分子代小鼠基因型鉴定结果如图1；Cre小鼠（黑色）和野生型C57小鼠（黑色）杂交，共获得子代41只，其中重组酶Cre表达阳性的小鼠22只（占总数53.7%），部分子代小鼠基因型鉴定结果如图2；DEPTORloxp/loxp与Cre小鼠杂交获得F1代58只，其中F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-鼠30只（占总数51.7%），部分子代小鼠基因型鉴定结果如图 3；DEPTORloxp/-。Cre+/-鼠与 DEPTORloxp/loxp鼠杂交，共获得F2代鼠43只，其中DEPTORloxp/loxp⁃Cre+/-10只（占总数23.3%），部分子代小鼠基因型鉴定结果如图4。

图1 DEPTORloxp/loxp小鼠基因型PCR鉴定结果Fig.1 PCR genotyping results of DEPTORloxp/loxpmice

图2 表达Cre重组酶小鼠基因PCR型鉴定结果Fig.2 PCR genotyping results of Cre recombinase mice

图3 F1代小鼠基因型PCR鉴定结果Fig.3 PCR genotyping results of the first⁃generation offsprings

2.2 QPCR、Western blot、免疫荧光验证DEPTOR基因敲除效果 提取KO小鼠和Control小鼠胰腺组织RNA逆转录成cDNA，根据特异性引物（表1B）进行定量PCR检测（QPCR），提取KO小鼠和Control小鼠胰腺组织蛋白进行Western blot检测。由结果图5可见，KO小鼠DEPTOR mRNA（A）与蛋白（B）表达水平低于Control小鼠，差异显著（Mean±SD，n=3）。**P＜ 0.05；进一步验证DEPTOR敲除效果是发生在胰岛β细胞，进行免疫荧光双标染色，结果如图5可见DEPTOR基因主要表达在胰腺导管，但在胰岛β细胞中也有表达，且DEP⁃TOR基因表达量Control小鼠（C图）要明显高于KO小鼠（D图）。

图4 F2代小鼠基因型PCR鉴定结果Fig.4 PCR genotyping results of the second⁃generation offsprings

图5 QPCR、Western blot、免疫荧光(20 ×)验证DEPTOR基因敲除效果Fig.5 QPCR、Western blot and Immunofluorescence(20 ×)were applied to identify the knockout effect of DEPTOR gene

表1 基因型鉴定（A）和QPCR（B）的引物信息Tab.1 Primer Information for genotyping（A）and QPCR（B）

3 讨论

随着对基因组学的研究深入，基因敲除技术的使用也越来越普遍，通过建立稳定的实验动物基因敲除模型是研究基因功能的常规策略。本文所提及的条件性基因敲除是利用Cre/Loxp重组系统介导基因打靶的方法。Cre重组酶由Cre基因编码，类似于一把基因剪刀，可识别特异DNA序列（如Loxp位点），可剪切掉Loxp位点之间的靶基因，从而达到靶基因敲除的目的。条件性基因敲除所指的是对Cre基因进行调控，在Cre基因插入特定的可被调控的启动子序列，即可人为的控制Cre基因的表达，从而可以在时间和空间研究某个特定基因的功能。

在人体，DEPTOR基因位于第八号染色体，8q24，12，分子量 48 kDa，是一类在 mTORCl和mT0RC2均含有的结合蛋白，以其PDZ域与mTOR相互作用。DEPTOR作为mTOR家族的一个重要成员，对细胞代谢也有着重要的影响。在肌肉中，Baf60c能通过激活DEPTOR介导的Akt/PKB通道促进糖的有氧氧化向糖酵解的肌纤维类型转变［5］。在肝脏，肝DEPTOR缺失改变空腹代谢转变［6］。DEPTOR还通过激活Akt⁃PPAR⁃γ信号轴能促进白色脂肪组织生成［7］。此外，有研究显示DEPTOR启动子区域基因突变与肥胖的儿童和青少年患胰岛素抵抗的发生风险显著下降相关［8］。由于对DEPTOR基因与糖代谢及糖尿病的研究多集中在细胞及组织水平，缺乏整体动物水平上的研究。因此，构建DEPTOR基因敲除小鼠模型对进一步深入研究DEPTOR的功能极为重要。此外，β细胞的研究在糖尿病研究领域占据着不可动摇的主导地位。本实验构建了条件性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，可在不同的时间节点上在胰岛β细胞对DEPTOR基因进行调控，能更进一步研究DEPTOR基因的功能。

综上所述，本实验利用Cre/Loxp重组系统成功构建了条件性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，该小鼠和正常野生型小鼠在生长速度、繁殖能力等方面无明显差异，在糖耐量上出现异常。这是国际上首次利用Cre/Loxp技术构建条件性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，为进一步研究DEPTOR基因与糖尿病发生机制中扮演的角色提供了重要的动物模型。

参考文献

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