RNA干扰CD133的表达逆转人结肠癌细胞对化疗药物耐药的研究

张念华 武如通 李寿杰 陈高峰

结肠癌的发病率不断增高，是目前我国最常见的消化道恶性肿瘤，很难早期发现及治疗，整体治疗效果并不好。化疗在结肠癌的综合治疗中占据重要地位。然而化疗过程中产生的多药耐药现象又会造成肿瘤治疗失败。肿瘤治疗过程中，总有部分肿瘤细胞可以逃避化疗药物的杀伤，这部分残留的肿瘤细胞随时有可能增殖形成新的肿瘤。能够逃避化疗药物杀伤的肿瘤细胞往往都是肿瘤干细胞。这部分细胞平时大都处于休眠状态，化疗药物并不能有效杀灭，多程化疗后往往会造成肿瘤干细胞残留。残留的肿瘤干细胞随时可能再进入增殖状态，导致结肠癌复发。在目前发现的肿瘤干细胞标志物中，CD133在结肠癌干细胞中多有表达，在耐药的结肠癌细胞中CD133的表达更是出现明显上调。本研究运用RNA干扰技术下调结肠癌耐药细胞株CD133的表达，观察其对耐药细胞株化疗药物敏感性的影响，以期为靶向CD133的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

lovo细胞株为人结肠癌肿瘤细胞，保存于中山大学华南肿瘤学国家重点实验室。细胞培养基为RPMI-1640培养基，购自Gibco公司，细胞培养过程中加10%的胎牛血清。

1.2 实验方法

1.2.1 人结肠癌耐药细胞株的建立 运用药物浓度梯度递增间歇诱导法建立人结肠癌lovo细胞耐5-FU细胞株。细胞培养液中首先加入2 mg/l的5-FU进行培养，培养48 h后更换普通培养液继续培养，待细胞重新长至对数生长期时，再次加5-FU进行诱导。在此过程中，不断增加5-FU的浓度，直到获得能在50 mg/l的5-FU浓度中稳定生长的细胞，并命名为lovo/5-FU。平时传代过程中，为维持其耐药性，培养液中加入50 mg/l的5-FU。运用MTT法检测结肠癌耐药细胞株的耐药能力，并计算半数抑制浓度(IC50)及耐药指数。

1.2.2 CD133特异性干扰载体的构建

CD133基因序列参考GeneBank数据库，选取针对CD133的干扰序列构建到慢病毒RNA干扰载体上，形成CD133特异性RNA干扰慢病毒载体。慢病毒载体中含G418抗性基因。取对数生长期的lovo/5-FU细胞，接种于12孔培养板中。密切观察细胞生长情况，待细胞汇合度达80%时，利用Lipofectamine TM2000将CD133特异性RNA干扰慢病毒载体转染lovo/5-FU细胞。转染时间为6 h，转染结束后更换为选择培养基进行培养，选择培养基中含浓度为800ug/ml的G418。继续培养2周后，挑选出抗性克隆，继续维持培养。

1.2.3 Western blot法分析CD133的表达

1.2.3.1 细胞总蛋白的提取及定量 将细胞上层培养液倒掉，经PBS冲洗后加蛋白裂解液，收集细胞裂解液保存备用。采用BSA法进行蛋白定量，根据蛋白定量结果及所需加的蛋白量计算加样量。

1.2.3.2 加样、跑胶及电转 根据目的蛋白的分子量选择相应浓度的胶。将marker及蛋白样品进行编号，按编号加入不同泳道。加样结束，进行跑胶及电转。

1.2.3.3 一抗反应及二抗反应 将CD133抗体以1∶2000的比例用5%脱脂奶-TBST溶液10 ml进行稀释，将PVDF膜浸入其中，进行一抗反应。反应结束后，二抗用5%脱脂奶-TBST溶液稀释至10 ml，将PVDF膜置于其中，进行二抗反应。二抗反应结束后，在暗房进行发光洗片。

1.2.4 细胞迁移实验

1.2.4.1 基质胶准备 首先将matrigel基质胶进行融化，应用无血清RPMI-1640培养基将融化的，在Transwell小室上室底部铺50μl稀释的matrigel基质胶。

1.2.4.2 细胞迁移 胰酶消化lovo肿瘤细胞，运用无血清的RPMI-1640培养基进行重悬，调整细胞密度至1×107个/L。100 μl不含血清的细胞悬液加入Transwell小室上室，下室加入含血清培养基。

1.2.4.2 染色观察 培养结束后取出transwell小室用PBS缓冲液漂洗2次，多聚甲醛固定细胞后，置入苏木精溶液中染色。染色结束后，显微镜下观察并计数。运用高倍视野(X 200)进行观察，随机选取上、下、中心、左、右5个视野，计算视野内侵出的细胞数。

1.2.5 MTT法测定对化疗药物耐药的逆转作用 选择结肠癌lovo细胞株及其对应的耐5-FU细胞株，共设3个组：空白对照组、化疗药物组、CD133特异性RNA干扰慢病毒载体联合化疗药物处理组。MTT法检测经转染CD133特异性RNA干扰慢病毒载体后，结肠癌耐药细胞株对化疗药物的IC50值，观察其对化疗药物耐药的逆转作用。重复三次，根据结果计算逆转倍数。

2 结果

2.1 结肠癌耐药细胞株的建立及耐药能力测定

通过运用药物浓度梯度递增间歇诱导法建立人结肠癌lovo耐5-FU细胞株(lovo/5-FU)。MTT法分析lovo及lovo/5-FU细胞株对5-FU的敏感性，结果显示，5-FU对lovo细胞株的IC50为14.2 mg/l，对lovo/5-FU细胞株的IC50为119.5 mg/l。根据耐药指数=子代细胞IC50(119.5 mg/l)/亲代细胞IC50(14.2 mg/l)，得出耐药指数为：8.42。

2.2 RNA干扰CD133的表达对化疗药物耐药的逆转作用

选择结肠癌lovo细胞株及其对应的耐5-FU细胞株(lovo/5-FU)，共设3个组：空白对照组、化疗药物组、RNA干扰联合化疗药物处理组。MTT法检测经CD133特异性RNA干扰慢病毒载体转染后，lovo/5-FU细胞株对5-FU的IC50值为11.2 mg/l：而对照组lovo/5-FU细胞株对5-FU的IC50为119.5 mg/l。根据逆转倍数RF=化疗药物组IC50(119.5 mg/l)/联合用药组IC50(11.2 mg/l)，得出逆转倍数(RF)为10.67。结果显示：RNA干扰CD133的表达后耐药性明显逆转。

2.3 Western blot法分析CD133的表达

lovo/5-FU细胞经CD133特异性RNA干扰慢病毒载体转染后，继续维持培养48小时，加入细胞裂解液收集蛋白，运用western blot法分析CD133的表达(设lovo对照组及lovo/5-FU对照组)。结果示：lovo/5-FU细胞CD133的表达水平显著高于lovo细胞；运用RNA干扰lovo/5-FU细胞CD133的表达后，其CD133的表达水平明显下调(图1)。结果表明RNA干扰有效。

图1 Western blot法分析CD133的表达

2.4 细胞迁移实验分析加入中成药后对结肠癌耐药细胞株迁移能力的影响

取对数生长期的lovo/5-FU细胞株进行Transwell迁移实验，迁移实验设四组：lovo/5-FU细胞株空白对照组、5-FU组(IC20浓度)、RNA干扰组、RNA干扰加5-FU(IC20浓度)组。实验结果显示：lovo/5-FU细胞株空白对照组侵出小室的细胞数目最多，迁移能力最强，平均每个高倍视野内侵出小室的细胞数为92.3±8.3个；5-FU组和RNA干扰组侵出小室的细胞数目较多，迁移能力稍弱于空白对照组，平均每个高倍视野内侵出小室的细胞数分别为67.5±8.2个和62.3±7.9个；RNA干扰加5-FU组侵出小室的细胞数目最少，平均每个高倍视野内侵出小室的细胞数仅有31.4±6.7个。

3 讨论

结肠癌在化疗过程中极易产生化疗耐药，产生的多药耐药(multidrug resistance，MDR) 现象是造成化疗失败的根源。结肠癌化疗失败后，肿瘤进展极易出现肠梗阻，出现肠梗阻患者对治疗的耐受性变差，预后不佳[1]。目前在结肠癌中也发现存在肿瘤干细胞，肿瘤干细胞具有高度自我更新能力，能够随时分化成增殖活跃的肿瘤细胞，造成肿瘤治疗失败，出现复发及转移[2]。在肿瘤治疗过程中，肿瘤干细胞可能逃避抗肿瘤药物的杀伤，逐渐产生耐药性，增殖形成新的肿瘤，新生肿瘤将会对抗肿瘤治疗产生更强的耐受，具有更高的增殖和转移潜能，从而导致肿瘤进展[3]。CD133与结肠癌肿瘤干细胞密切相关，在其中多有表达[4]。来自于结肠癌的CD133阳性肿瘤细胞具有高度的致瘤性，种植在裸鼠中能够形成肿瘤，CD133阴性肿瘤细胞则不能形成肿瘤[5]。

本研究首先运用药物浓度梯度递增间歇诱导法建立人结肠癌lovo耐5-FU细胞株，同时构建了CD133特异性RNA干扰慢病毒载体。Western blot法分析发现，出现耐药性的lovo/5-FU细胞株较lovo细胞株CD133表达明显上调。结肠肿瘤标本中CD133阳性表达是手术患者预后不良因素之一，同时也是接受5-FU化疗患者的预后不良因素。CD133低表达患者具有更好的生存率[6-8]。lovo/5-FU细胞株在耐药过程中出现CD133的表达提示预后不良。我们运用CD133特异性RNA干扰慢病毒载体转染lovo/5-FU细胞株后，其CD133的表达出现明显下调。伴随着CD133的表达下调，lovo/5-FU细胞株对化疗药物的耐药性也出现逆转。同时细胞迁移实验表明，经转染CD133特异性RNA干扰慢病毒载体后，细胞迁移能力明显下降。这表明，运用RNA干扰下调CD133的表达能够逆转肿瘤细胞的耐药，提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。RNA干扰下调CD133的表达对化疗具有增敏作用，在结肠癌基因治疗中有望成为新的治疗靶点。

肿瘤干细胞大多处于休眠状态，传统化疗药物仅能杀伤增殖活跃的肿瘤细胞，并不能有效杀灭处于休眠状态肿瘤干细胞，这是肿瘤复发、转移的重要原因。CD133的表达能够预测结肠癌患者的预后，CD133低表达患者预后较好，高表达患者预后较差。CD133高表达的患者除了给予辅助化疗外，还应该考虑新的治疗方法[9]。有研究表明靶向CD133的溶瘤腺病毒能够选择性的感染并杀死CD133阳性的结肠癌细胞[10]。我们的研究表明在结肠癌细胞株lovo细胞在对5-FU发生耐药后，出现CD133的表达上调。运用RNA干扰方法抑制CD133的表达，可逆转肿瘤细胞的耐药性。

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