宫颈癌组织中miR-206、BAG3表达水平与临床意义

李春茹 胡长青 战 扬

1.山东省夏津县人民医院(253200)；2.山东省德州市人民医院

我国目前宫颈癌居女性生殖系统恶性肿瘤首位[1]。微小RNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性非编码RNA，能够与对应的靶基因配对达到降解信使RNA或抑制其翻译，从而影响细胞的发育、增值、分化、凋亡等生命过程[2]。有文献报道，miRNA具有原癌基因和抑癌基因的作用，对肿瘤的形成、发展等起着重要的作用[3-4]。宫颈癌患者体内的miRNA与正常女性存在明显差异[5]。BAG基因是近年来发现的对细胞凋亡起抑制作用的基因家族，家族中存在多个系列，分别命名为BAG(1-6)，该系列基因分泌多功能相结合的蛋白分子能够参与细胞存活、凋亡、增值等过程。在BAG基因中最常见的BAG3能够对细胞周期进行调控。研究发现，该基因在胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、卵巢癌等肿瘤组织细胞中均有表达[6]。本文通过检测宫颈癌组织中miR206、BAG表达，分析两种指标对临床病理影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集本院2010年1月—2012年1月收治的宫颈癌患者80例临床资料，年龄27～69岁。其中鳞癌69例，腺癌11例，均行病理检查确诊且无合并性疾病以及免疫相关性疾病。病理分级为G121例，G235例，G324例；按照现有国际妇产联盟(FIGO)分期标准为Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ～Ⅳ期34例。术后取组织标本液氮置-80℃保存，记录患者临床、病理资料。本次参与研究患者均未接受放疗和化疗，且通过本院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 定时定量PCR(RT-PCR)

1.2.1组织总RNA提取及质量鉴定取少量冷冻宫颈癌或正常组织，超声匀浆后加入1ml TRIzol试剂提取组织中RNA，使用DEPC溶解，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；使用Bio-Rad检测RNA浓度以及纯度，使用分光光度计测定A260和A280并计算两者比值(A260/A280)，1.8～2.0备用。

1.2.2逆转录反应根据试剂盒操作说明进行逆转录反应，逆转录500ngRNA，同时加入以下试剂：5×Buffer2ul，RT-Mix0.5ul，5×RT primer2ul，加入DEPC水至10ul。按照温度梯度反应37℃15min、85℃5s、0℃5min，反应后冻存备用。

1.2.3 RT-PCR反应体系2×PremixExTaq2ul，2×MicroRNA1ul，cDNA2ul，10×ROXⅡ2μl添加高温高压灭菌水至20ul。在反应仪器中反应30s(95℃)变性处理；再进行PCR梯度反应循环40次，95℃5s、60℃34s，以U6RNA为内参，按照相关方法测定循环阈值(Ct值)，计算Δ Ct=miR206 Ct值、-U6 Ct值，以2-ΔΔCT表示miR-206表达水平[7]。

1.3 免疫组化

采用二步法免疫染色方法，石蜡包埋切片制片。使用二甲苯脱蜡30min，无水乙醇洗5min,采用高梯度酒精每个洗5min(95%、80%、70%)，最后蒸馏水及PBS缓冲液各洗5min。置于pH6.0的枸橼酸缓冲液中，高压煮沸1min，自然冷却，PBS冲洗。添加一抗[(兔抗体BAG3多克隆抗体工作液(1：1000)，二抗工作液(1:100)]，4℃冷藏保存，PBS冲洗数分钟；DAB显色，反应时间 30～50s，在显微镜下观察控制，当出现棕黄色阳性颗粒而周围组织无特异性显色时停止蒸馏水冲洗，改用PBS冲洗5min×3次。苏木素复染，返蓝。按照梯度酒精脱水干燥，树胶封片，同时以PBS溶液代替一抗作阳性对照。

1.4 随访调查

对80例宫颈癌患者定期随访60个月，了解患者肿瘤发展状况以及生存情况。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 宫颈癌组织miR-206表达

计算A260/A280比值符合要求，凝胶电泳检测显示25s、16s和5s条带清晰，见图1。

图1 部分总RNA凝胶电泳

2.2 宫颈癌组织miR-206表达与病理特征关系

数据分析显示，不同的病理分级、间质浸润深度以及淋巴结转移的宫颈癌组织中miR比较存在差异(P<0.05)；年龄、临床分期、肿瘤大小以及绝经情况与组织中miR-206无差异(P>0.05)。见表1。

2.3 宫颈癌组织BAG蛋白表达

80例宫颈癌组织以及癌旁组织免疫组化检测结果显示，有51例宫颈癌组织中BAG3蛋白表达明显高于癌旁组织，29例癌旁组织BAG3蛋白表达高于宫颈癌组织，见图2。

2.4 BAG蛋白表达与临床病理关系

数据分析显示，BAG3的表达与年龄、肿瘤大小、分期、间质浸润深度、淋巴结转移、死亡等不相关(P>0.05)，与肿瘤分化、是否复发具有相关性(P<0.05)。通过Cox模型多因素分析，宫颈癌中BAG3表达是影响宫颈癌预后的独立因素。见表2、表3。

2.5 miR-206、BAG3表达对宫颈癌患者生存影响

随访结果显示，miR-206低表达患者生存时间(38.1±8.2月)低于高表达患者生存时间(55.3±5.1月)(P=0.031)。BAG3低表达患者生存时间(56.3±3.9月)高于高表达患者生存时间(35.4±7.9月)(P=0.023)。

表1 宫颈癌组织中miR-206表达与病理特征的关系

A：宫颈癌组织中阳性表达 B：癌旁组织中阳性表达 C：宫颈癌组织中阴性表达 D：癌旁组织中阴性表达图2宫颈癌组织及癌旁组织总BAG3的表达

表2 不同临床病理特征宫颈癌组织BAG蛋白表达

表3 宫颈癌患者预后的Cox模型多因素分析

3 讨论

近年来，对肿瘤的研究已经从组织水平深入到基因水平，宫颈癌的发生、变化是受到多种基因影响且机制复杂的过程[8-9]。miRNA参与细胞生长过程，近年来成为医学研究肿瘤发病机制的热点[10]。大量文献报道miRNAs在体内的变化与肿瘤的发生、成长具有重要的联系[11-12]。miR-206是一种肿瘤抑制miRNA，尤其在恶性肿瘤中起重要作用，文献报道miR-206能够在前列腺癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌等表达下调，可明显抑制细胞侵袭[13-14]。本次数据看出，病理分级不同患者，体内miR-206存在明显不同。说明不同的分化程度能够直接影响到体内miRNA的含量。间质浸润深度也对该项指标存在较大的影响，浸润越深，miR-206含量越低，与肿瘤分化程度存在正相关。淋巴结转移后，miR-206含量明显下降，与淋巴结未转移患者存在差异，但在临床分期、年龄、肿瘤大小以及是否绝经等方面未见差异，说明这些指标不是影响宫颈癌的重要因素。以上结果与文献报道结果一致[15-16]，印证了miR-206对肿瘤发生发展的影响。

BAG3广泛存在恶性肿瘤中，参与整个肿瘤形成发展过程[17]，但BAG3在宫颈癌中的表达相关研究文献较少。本研究观察了BAG3在宫颈癌组织、癌旁组织表达，结果存在不同，因此通过BAG3检测可从蛋白水平来深入研究宫颈癌的发生发展。另外，BAG3表达与不同肿瘤分化程度及复发与否均有差异，但BAG3表达与淋巴结转移与否不存在差异。5年的定期随访结果显示miR-206低表达患者生存时间低于高表达患者，BAG3低表达患者的平均生存时间高于高表达患者，与文献报道结果一致[18]。BAG3的表达为宫颈癌的独立因素，提示可从蛋白分子水平开展相关宫颈癌的发生机制研究。

综上，宫颈癌组织与癌旁组织miR-206及BAG3表达均存在不同，且两者间呈负相关。通过寻找更合适的miRNA以及蛋白表达来反映宫颈癌的发生发展，可为临床治疗提供新的治疗靶点。