外周血胎儿游离DNA检测在无创性产前诊断中的价值

吴玥丽 张琳琳 赵 玲 朱重阳 李 琳 李 莹

河南省妇幼保健院(郑州大学第三附属医院)(郑州，450052)

染色体非整倍体是妊娠早中期常见的染色体异常，胎儿非整倍体是新生儿出生缺陷、围产期胎儿死亡的主要原因。产前筛查是降低染色体异常儿出生行之有效的手段。羊水染色体核型分析诊断胎儿非整倍体准确率较高，达98%～99%[1]，是诊断胎儿染色体非整倍的金标准，但是该方法属于有创性操作，可增加术后流产、羊水渗漏、宫内感染等风险，发生率达0.3%～1.0%[2]，且不适用于有羊水穿刺禁忌孕妇。因此无创产前检测成为胎儿染色体异常筛查的研究方向，而传统无创性筛查的假阳性率达5%～8%[3]。孕妇外周血胎儿游离 DNA 无创产前检测是对高通量大规模基因组测序，大大提高了准确率，其检查敏感性、特异性可达99%，假阳性率为0.1%[4]。本研究回顾性分析了本院行外周血胎儿游离DNA无创性产前检测及羊水穿刺胎儿染色体核型分析的孕妇资料，探讨其检测诊断胎儿非整倍体染色体的效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入对象均为产前诊断的适应对象，孕妇年龄≥35岁；唐氏征筛查高风险；不良妊娠史；孕早期服用致畸药物；孕育染色体异常胎儿病史；染色体异常家族史；羊水过多或过少；B 超提示胎儿异常。排除标准：资料缺失；正常妊娠孕妇。依据以上标准选择2017年1月—2017年12月于本院行外周血胎儿游离DNA无创性产前检测和羊水穿刺胎儿染色体核型分析的孕妇616例，年龄(38.0±2.1)岁(35～39岁)，孕周(20.4±5.2)周(12～24周)。

1.2 DNA检测

采集孕妇外周血 10 ml 于EDTA 抗凝管充分混匀中，4℃条件下分离血浆提取DNA，紫外分光光度法鉴定DNA纯度和完整性，运用高通量基因检测技术进行DNA测序。三体高风险诊断标准：Z=(待测染色体的比例-总体人群的比率)/对照组待测染色体方差，Z≥3为三体高危，Z≤3为单体高危。

1.3 染色体核型分析

常规消毒，超声引导下经腹壁穿刺子宫至羊膜腔抽取羊水20 ml离心取沉淀物加入羊水培养瓶，置37℃、5% CO2培养箱8～12d，适当更换培养液;观察羊水细胞生长良好，加入秋水仙素，经37℃低渗、固定、制片、G显带、染色处理，进行计数和染色体核型分析。采用徕卡GSL-120扫描系统采集分裂相,CytoVision软件分析数据,核型描述按照ISCN2016进行描述。

1.4 统计学分析

设a为真阳性数，b为假阳性数，c为假阴性数，d为真阴性数，敏感性=a/(a+c)，特异性=d/(b+d)，阳性预测值=a/(a+b)，阴性预测值=d/(c+d)。SPSS22.0进行数据分析，ROC分析胎儿游离 DNA无创性产前检测诊断胎儿非整倍体的效能。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DNA无创性产前检测与羊水染色体核型分析

DNA无创性产前检测共检出胎儿染色体非整倍高风险11例，其中 21-三体高风险(47,XN,+21)5例，18-三体高风险(47,XN,+18)3例，13-三体高风险(47,XN,+13)1例；羊水染色体核型分析检出染色体非整倍体12例，其中21-三体5例，18-三体3例，13-三体1例，符合率100%。此外，DNA无创性产前检测性染色体非整倍体(47,XXY/47,XXX)2 例，羊水染色体核型分析结果3例，符合率66.67%；总体符合率91.67%。

2.2 DNA无创性产前检测诊断胎儿非整倍体效能

以羊水染色体核型分析结果为金标准，游离 DNA无创性产前检测胎儿非整倍体的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度分别为91.7%、100.0%、100.0%、99.8%、99.8%、95.0%，ROC分析其曲线下面积为0.958(95%CI：0.867～1.000)，见图1。

图1 胎儿游离DNA无创性产前检测诊断胎儿非整倍体的ROC图

3 讨论

我国每年新生儿为出生缺陷儿中10%为遗传因素导致[5]，而染色体异常新生儿中95%为非整倍体异常[6]，产前筛查是降低染色体异常胎儿的主要措施。医学界一直在寻找一种无创获得胎儿DNA的方法。母体外周循环血中胎儿细胞数目十分微量，如何有效提取胎儿细胞成为无创检测胎儿DNA的关键，游离胎儿 DNA 片段的发现[7]，促进了无创性产前检测突飞猛进的发展。Dan等[8]采用高通量测序技术检测来自母体血浆中的胎儿游离DNA片段，检测染色体异常与有创检测结果符合率达100.0%。近年来，国内也开展了大量无创检测胎儿DNA的研究，均取得了较高的检测准确率[9]。

本研究采用高通量测序技术检测孕妇外周血中胎儿游离DNA片段，与羊水染色体核型分析结果比较，胎儿染色体非整倍与核型分析符合率100.0%。从诊断效能来看曲线下面积达0.883，灵敏度和特异度达88.0%、82.6%，验证了该技术的临床价值。表明，孕妇外周血胎儿游离DNA检测可有效检测胎儿染色体非整倍体异常。DNA无创性产前检测性染色体非整倍体与羊水染色体核型分析符合率66.7%,总体符合率达91.7%。无创检测技术对性染色体异常的检测效能较低，可能与孕妇游离 DNA 含量有关；或与孕妇性染色体异常嵌合体或局限性胎盘嵌合体有关，因为孕妇本人为性染色体异常嵌合体或存在局限性胎盘嵌合体会造成测试结果不准确[10]。

无创产前检测技术也存在一定的局限性：无法完全区分母体来源DNA片段与胎儿游离DNA片段；由于检测到的胎儿游离DNA片段来自母体胎盘滋养层脱落细胞，该细胞在母体外周血中含量极少，使检测结果受取材质量的限制较大[11]；由于胎儿游离DNA来自滋养层细胞，如果存在局限性胎盘嵌合，滋养层细胞异常，而胎儿正常，由此导致检测结果假阳性；该方法检测的是胎盘滋养层DNA，在无法有效区分胎儿DNA 和母体 DNA情况下，难以根据DNA基因测序结果推断染色体非整倍体[12]。因此，临床诊断非整倍体胎儿仍需要结合多项检测结果做出最终判断，不能仅依赖单一的检测手段。

综上，无创性胎儿游离DNA检测可有效检出胎儿染色体非整倍体，实现了通过分析母体血样诊断胎儿情况的无创检测，为临床诊断提供了多种选择的可能，是一种可靠的产前检测方法，但不排除存在假阳性及假阴性的可能。