新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9的技术优势与应用局限

吴言 郝雅荞，2 韦璇，2 沈琦 柳叶飞 王升厚 赵洪新

（1. 浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018；2. 沈阳师范大学生命科学学院，沈阳 110034；3. 沈阳师范大学教学实验中心，沈阳 110034）

近年来，有关位点特异性核酸酶（Site-specific nuclease，SSN）的基础理论研究取得了突破性进展，使精准基因编辑技术在生物学、医学和农业等领域得到了广泛应用，也取得了令人瞩目的成就。位点特异性核酸酶在生物体的基因编辑中提供了十分精准有效的DNA切割方法［1］，其中，锌指核酸酶（Zine finger endonuclease，ZFN）以及类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALENs）已被广泛应用于基因工程技术中。这两种核酸酶的切割原理相同，均是将DNA结合蛋白与核酸内切酶FokI融合完成双链特异性切割，但两种酶DNA结合结构域较为复杂，操作上技术难度相对大，耗时长且容易脱靶［2-4］，成为制约其发展的障碍。2013年，Cathomen［5］基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成人工核酸内切酶 CRISPR Cas 9，在真核和原核生物中进行精准基因编辑尝试，获得巨大成功。这种全新的基因组定点编辑技术以制作简单、成本低、作用高效［5］等优势迅速发展，并成功应用于各种原核生物和真核生物中，包括大肠杆菌［6］、酿酒酵母［7］、链霉菌属［8］、高等植物［9］、家蚕［10］、果蝇［11］和人类细胞［12-14］等。本文从 CRISPR/Cas的来源、结构、作用机理及影响CRISPR/Cas打靶效率的因素等方面进行总结，旨为深刻理解其工作原理和在精准基因编辑中应用提供参考。

1 CRISPR/Cas系统的研究历史

1987年，日本科学家在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列［15］，但由于其功能无法确定，并未引起科学家的注意。……