基于CRISPR/Cas9系统构建FOXA2表达示踪体系

程浩杰 张振旺 谭桂湘 刘昱翔 卜会铜 谭拥军

（湖南大学生物学院，长沙 410082）

2002年，Jansen等［1，2］首次定义了存在于细菌或古细菌中的抵御噬菌体入侵感染的CRISPR/Cas 系统。该系统由成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）结构，以及CRISPR相关的蛋白 质（CRSPR-associated protein，Cas9） 组 成［3，4］。CRISPR/Cas9系统大体分为三个类型，其中的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统仅需一种Cas9蛋白就能独立对靶DNA有效切割［5］。该系统依赖质粒转录的一段单链向导RNA（single guide RNA，sgRNA）和其序列互补的靶DNA形成RNA-DNA复合物来决定CRISPR/Cas9核酸酶特异性［6］。由于该系统设计简单，仅需完成一个克隆改变Cas9质粒的小段gRNA前序列即可特异性靶向切割，并且适用范围广阔，目前已有报道在动物［7-8］、植物［9-11］、微生物［12-13］和病毒［14-15］等都具有显著的切割活性。该系统靶向切割细胞基因组后，细胞利用自身同源性定向修复（Homology directed repair，HDR）机制实现带有同源臂的外源序列插入，是目前染色质定向改造主要方式之一。

基因 FOXA2［16］，曾用名是 HNF3β，定位于人染色体中20p11，全长45 kb，包含3个外显子以及两个内含子。其蛋白长度为457个氨基酸。FOXA2蛋白属于叉头框（Fox）家族的成员。因该家族蛋白具有一组高度保守的翼状螺旋区域，主要特征是作为转录因子作用于DNA结合区域，所以又称为转录因子FOXA2。Fox家族蛋白最先被发现于胚胎发育的进程中，深入研究发现Fox家族蛋白在免疫调节，周期调控等多个生理过程中发挥着重要的作用。转录因子之一的FOXA2近年来被发现与能量代谢、胰腺发育、癌症与上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）等都有紧密的关系［17，18］。

完成基因FOXA2的内源性示踪且不干扰基因本身的转录翻译与蛋白质修饰，是一种很好的追踪FOXA2基因表达开启与关闭的方法。……