双重响应性POSS基嵌段共聚物的合成及其溶液自组装行为的研究

孙晓晴,曹 杰,李纪录,何锴慰,许一婷,戴李宗

(厦门大学 材料学院,福建省防火阻燃材料重点实验室,福建 厦门 361005)

人体中存在许多天然屏障保护机体不受侵害,但同时也给疾病的治疗设置了障碍.聚合物纳米粒子经过适当的修饰,可以跨越生物膜屏障,将药物传送到全身组织[1],同时还可利用机体病变部位环境因素的变化刺激对其具有响应性的聚合物纳米粒子载体发生物理化学性质变化,使药物在特定部位释放.响应性是聚合物纳米粒子引人注目的特点之一[2],目前已有大量关于pH、温度、光等刺激响应性药物释放体系的报道[3-5].而与传统的单一响应性聚合物相比,多重响应性共聚物已成为一个重要的研究方向.Wei等[6]制备的三嵌段共聚物PEG45-B-PNIPAAm380-b-P(NIPAAm423-co-N-HEAAm42),分别在37和48 ℃显示出低临界溶解温度(lower critical solution temperature,LCST),其组装结构可在胶束(37～45 ℃,约260 nm)和囊泡 (>50 ℃,约420 nm)之间转化.Sahoo等[7]合成了一种温度和pH双重响应的核-壳纳米颗粒,以刺激性聚合物为壳,磁性纳米颗粒为核,可作为抗癌药物强力霉素(DOX)的载体和癌细胞特异性靶向剂,结果表明DOX在所需的溶酶体pH和温度条件下可优先持续释放.

多面体齐聚倍半硅氧烷(polyhedral oligomeric silsesquioxane,POSS)的化学分子通式为(RSiO1.5)8,R为氢原子或有机官能团,如脂肪族烷基、芳香族烃基、丙烯酸酯、羟基以及它们的衍生物.POSS分子笼形结构的顶角硅原子可以连接有机取代基,有利于将无机杂化结构引入大分子链中,赋予聚合物新的物理和化学性能,大大拓展了其应用范围.POSS还具有低毒性和良好生物相容性等优势,可作为生物材料[8-9],并被广泛研究.同时POSS的笼形立体结构使得大分子之间的堆积不是很紧密,相对于一般双亲性嵌段共聚物,POSS 基嵌段共聚物具有更加稳定的形态,在高浓度下不易缠结,稀释也不易裂解.本研究利用POSS的强疏水性有助于形成稳定内核负载客体分子的特点,将其与温度响应性N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和pH响应性丙烯酸(AA)单体共聚,通过可逆加成-断裂转移聚合法(reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization,RAFT)制备了具有双重响应性的POSS基嵌段共聚物,并研究了其在水中的自组装行为、pH响应性和温度响应性.

1 实验部分

1.1 实验原料

图1 嵌段共聚物的合成Fig.1 Synthesis of block copolymers

甲基丙烯酰氧丙基七异丁基笼形倍半硅氧烷(MAPOSS,纯度98%)购自Hybrid Plastic公司.2-苯基-2-丙基苯并二硫(CDB,纯度99%)、NIPAM (纯度99%)、丙烯酸叔丁酯(tBA,纯度98%)、三氟乙酸(TFA,分析纯)、偶氮二异丁腈(AIBN,分析纯)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司.氢氧化钠、无水乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司.高纯氩气(Ar,纯度99.99%)购自林德公司.

1.2 合成方法

1.2.1 嵌段共聚物PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)的合成

以CDB作为链转移剂,通过RAFT合成POSS基嵌段共聚物,反应过程如图1所示:1) 依据文献[10]所述方法,合成不同聚合度的大分子链转移剂PMAPOSS10、PMAPOSS15、PMAPOSS20;2) 分别以不同聚合度的PMAPOSS为大分子链转移剂,AIBN作为引发剂,固定反应单体NIPAM和tBA的摩尔比，合成PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA)嵌段共聚物；3)将上述嵌段共聚物在添加TFA的条件下水解,得到PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)嵌段共聚物[11].其中PMAPOSS20-b-(PNIPAM50-co-PAA150)的合成步骤如下:将PMAPOSS20(0.957 g,0.05 mmol)、AIBN(1.64 mg,0.01 mmol)、NIPAM(0.283 g,2.50 mmol)和tBA(1.087 mL,7.50 mmol)溶于2 mL THF中,经连续冻融脱气3～5次,在65 ℃氩气保护下反应54 h,经液氮淬冷停止反应;选择V(甲醇)∶V(水)=2∶1为沉淀剂,反复沉淀3次,真空干燥得到橘红色固体,即PMAPOSS20-b-(PNIPAM50-co-PtBA150)；将PMAPOSS20-b-(PNIPAM50-co-PtBA150)(0.378 g,0.99 mmol tBA单元)加入到40 mL二氯甲烷中,搅拌15 min以溶解共聚物;然后快速滴入过量TFA(1.1 mL,14.85 mmol,15倍过量于AA单元),置于室温下搅拌36 h;最后通过旋蒸除去二氯甲烷和TFA;产物用二氯甲烷洗涤3次,常温下真空干燥得到淡黄色固体即为PMAPOSS20-b-(PNIPAM50-co-PAA150).按照所选大分子链转移剂的聚合度,将水解前的嵌段共聚物命名为Bt-10、Bt-15、Bt-20,水解后的嵌段共聚物则相应地命名为Ba-10、Ba-15、Ba-20.

1.2.2 共聚物胶束以及包覆芘的胶束溶液的制备

将5 mg PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)共聚物溶于1 mL THF中,然后将共聚物溶液逐滴加入到5 mL蒸馏水中,在常温下敞口静置,待THF 完全挥发后得到共聚物胶束溶液,取样进行测试.以丙酮为溶剂配制芘丙酮溶液(0.05 mg/mL),取预定体积的溶液与5 mL 1 mg/mL的共聚物母液(以THF为溶剂配制)混合,将混合溶液逐滴加入到5 mL的蒸馏水中,在通风橱中静置，待丙酮和THF完全挥发后,即可获得包覆芘的胶束溶液(1 mg/mL),取样进行后续测试.

1.3 测试与表征

采用Nicolet Avatar 360红外光谱仪,全反射模式(ATR)测定傅里叶变换红外(FT-IR)光谱.采用Bruker AV 400核磁共振波谱(NMR)仪(400 MHz)，CDCl3作为溶剂,四甲基硅烷(tetramethylsilane,TMS)为内标测定1H-NMR.超高效聚合物色谱(APC)测试数据采用PSS Win GPC系统采集,THF为流动相,甲苯为内标,25 ℃,流速0.5 mL/min.采用Malvern公司的Nano ZS粒径分析仪,500 nm波长散射角度为90°的氩离子激光器(400 mW)进行胶束溶液的动态光散射(DLS)及Zeta电位的测试.采用JEM2100高分辨透射电子显微镜(TEM)观察样品微观形貌,加速电压为200 kV,样品用200目铜网捞取,干燥后直接观察.采用F7000型荧光分光光度计测定荧光光谱,激发狭缝宽度为2.5 nm,发射狭缝宽度为2.5 nm,扫描速率为240 nm/min.采用岛津公司的UV-2550紫外-可见分光光度计测定胶束溶液在500 nm处的紫外光透过率.

2 结果与讨论

2.1 嵌段共聚物的结构表征

图2 PMAPOSS(A)、PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA)(B)和PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)(C)的1H-NMR谱图Fig.2 1H-NMR spectra of PMAPOSS (A),PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA) (B) and PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA) (C)

用PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)谱图中未水解的叔丁基质子峰(δ=1.45)和Si—CH2(δ=0.6)特征峰的积分面积比代表未水解的tBA量(nr(tBA)),PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA)谱图中相应积分面积比代表共聚物中tBA的总量(nt(tBA))，tBA水解率的计算公式如下:

η=[1-(nr(tBA)/nt(tBA))]×100%.

嵌段共聚物的合成及水解情况如表1所示.

2.2 嵌段共聚物的临界胶束浓度(CMC)测定以及形貌表征

采用芘荧光探针光谱法测定嵌段共聚物的CMC[12].在室温下芘的荧光光谱由5个振动带组成,其中373和384 nm处谱带的荧光强度I1和I3随分子微环境的变化而变化，因此I3/I1常被用作检测分子微环境极性的一个指标.测定不同浓度POSS基嵌段共聚物包芘溶液在373和384 nm处的荧光强度I1和I3,以嵌段共聚物浓度的对数(lgρ)为横坐标,I3/I1为纵坐标作图,所得拟合曲线的交点处所对应的浓度值即为嵌段共聚物的CMC.由图4可得,Ba-10、Ba-15和Ba-20的CMC分别为3.6,3.0和2.3 mg/L.结果表明：CMC随着嵌段共聚物结构中PMAPOSS链段的增长而减小;Ba-10、Ba-15和Ba-20的CMC都很小,说明三者在很低的浓度下就可以获得稳定的胶束结构.

图3 PMAPOSS，PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA)和PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA) 的FT-IR谱图Fig.3 FT-IR spectra of PMAPOSS，PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PtBA) and PMAPOSS-b-(PNIPAM-co-PAA)

表1 嵌段共聚物的合成及水解结果

注：原料投料比n(NIPAM)∶n(tBA)∶n(PMAPOSS)∶n(AIBN)=50∶150∶1∶0.2;各链段聚合度采用1H-NMR法计算.

图4 Ba-10、Ba-15和Ba-20的I3/I1值与溶液浓度对数的关系Fig.4 Relation between I3/I1 and lg ρ of Ba-10,Ba-15 and Ba-20

图5(A)～(C)为Ba-20在水中自组装所得胶束的TEM图，可以直观地观察到Ba-20在水溶液中能形成结构较为规整且稳定的胶束,并表现出明显的核-壳结构.图5(D)为胶束溶液的DLS测试结果,可以看出Ba-10、Ba-15和Ba-20在水溶液中自组装形成的胶束尺寸分别为为161,183和205 nm,多分散系数(PDI)为0.083,0.191和0.139.其中,Ba-15的PDI较Ba-10和Ba-20大很多,这可能是因为Ba-15中PNIPAM和PAA链段的长度比为34∶101=1∶2.97,是3种嵌段共聚物中PAA链段所占比例最低的(Ba-10和Ba-20中PNIPAM和PAA链段长度比值分别为1∶3.07和1∶3.19)；而随着PAA链段比例的降低,形成胶束的PAA链段排斥力降低,疏水性下降,更多的嵌段共聚物可以缔合在一起形成尺寸更大的胶束,组装的可控性变差,导致得到的胶束尺寸不均一.

图5 Ba-20胶束的TEM图(A～C)和Ba-10,Ba-15,Ba-20胶束的DLS结果(D)Fig.5 TEM images of Ba-20 micelle (A-C),and DLS results of Ba-10,Ba-15,Ba-20 micelles (D)

2.3 嵌段共聚物的pH响应行为

图6 嵌段共聚物胶束的粒径(A)和溶液透光率(B)随pH的变化曲线Fig.6 Variation curves of block copolymer micelle size (A) and transmittance of block copolymer micelles solution (B) with pH

嵌段共聚物胶束溶液粒径随pH的变化情况如图6(A)所示,pH由10.0下降到4.0的过程中,胶束粒径变化不大,在200 nm左右波动;但是,当pH小于3.0时,粒径明显增大,甚至增加到3 μm左右;从图6(A)的插图可以看出,胶束粒径在显著增大之前有一段小范围内的下降,这可能是因为:在pH较大时,胶束中壳层的PAA链段的羧基变成羧基阴离子,链段亲水性增强,分子链段变得较为伸展,电离程度不同,链段之间的排斥力也有所不同,但对胶束的整体形态影响不大,只是尺寸发生少许变化,粒径较为稳定;而随着pH的下降,羧基阴离子转变为羧基,链段疏水性增强,PAA链段之间的静电斥力减小,链段由原来的伸展状态变为蜷缩状态,胶束粒径会有下降的趋势,但是因为PAA中的羧基可以和PNIPAM中的酰胺基团发生分子链内或分子链间的氢键络合作用,使胶束聚集在一起,甚至可能生成沉淀,导致胶束粒径急剧增大.而3种嵌段共聚物中Ba-20的PAA链段比例最大,表现出最强的pH响应性,胶束粒径在pH较大时发生突变;Ba-10和Ba-15随pH的增大粒径的变化趋势相差不大.图6(B)为室温下1 mg/mL嵌段共聚物胶束溶液的透光率随pH的变化曲线.在pH 3.0～10.0范围内溶液透光率随着溶液pH的升高而增加,其中在pH 3.0～5.0范围内增加很明显,该变化趋势与DLS的测试结果相符.pH为1.0时透光率较高，这是由于此时嵌段共聚物纳米粒子发生聚集而沉淀,DLS的测试结果也显示此时粒径为微米级.

图7 嵌段共聚物胶束的Zeta电位随pH(A)及温度(B)的变化曲线Fig.7 Variation curves of Zeta potential of block copolymer micelles with pH (A) and temperature (B)

图7(A)显示了在25 ℃下Ba-10、Ba-15和Ba-20在不同pH下的Zeta电位值,总体上是随着pH的增大而减小.Ba-20、Ba-10和Ba-15 3种嵌段共聚物中n(AA)∶n(NIPAM)=3.19,3.07,2.97.由图可见,嵌段共聚物分子链中PAA链段的比例越大,Zeta电位随pH的变化速率越快,嵌段共聚物的等电点越小,依次为1.85,1.97和2.08.Zeta电位的变化趋势和PAA的电离程度有很大关系,当pH为等电点时,胶束表面基本上不带电荷,当pH增大时PAA电离程度加大,共聚物带上负电荷,Zeta电位变为负值;当pH增大到一定程度后,Zeta电位的降低变得缓慢.而由图7(B)可看出，随着温度的改变,嵌段共聚物的Zeta电位变化不大,说明温度改变对嵌段共聚物的pH响应性影响不大.Zeta电位随溶液pH的变化进一步验证了上述嵌段共聚物对pH响应性原理的推论.

图8 不同pH下包芘共聚物胶束对芘的释放比例随时间的变化曲线Fig.8 Variation curves of pyrene release percentage of pyrene-copolymer micelles with time under different pH

图8为不同pH下包芘共聚物胶束对芘的释放比例随时间的变化曲线.在pH=6.58时随时间延长其荧光强度(I3)下降很慢;当pH下降至5.02时,其荧光强度在30 min内就下降很多.这可能是因为在pH较小时,PAA链段疏水性增强,胶束收缩使得核内包裹的芘释放到溶液中;相反地,在较高pH下,共聚物中羧基阴离子使分子链之间静电排斥力增大,链段在溶液中伸展,形成稳定胶束,同时能稳定负载芘.在pH=5.02时,Ba-10和Ba-15包芘共聚物胶束在2 h内对芘的释放就基本达到了平衡,而Ba-20达到平衡的时间为4 h;且Ba-20对芘的释放速率低于Ba-10和Ba-15,原因是Ba-20包芘共聚物胶束拥有较大的疏水核,虽然能包覆更多芘,但是同时芘释放到外部环境中所要经过的“通道”也更长.从图中还可以看出,相比于在pH=6.58时,3种嵌段共聚物对芘的释放比例在pH=5.02时短时间内就能达到很高,这可能是因为质子化的羧基与酰胺基的氢键络合作用使胶束的稳定性变差,有利于芘快速而大量的释放.

2.4 嵌段共聚物的温度响应行为

进一步研究了嵌段共聚物胶束的粒径随温度的变化趋势.将嵌段共聚物溶液的LCST定义为粒径发生突变的起始点所对应的温度.由图9可知,在Ba-10、Ba-15和Ba-20的粒径随温度变化曲线中,粒径有明显的突变阶段,突变点所对应的温度分别为35,30 和15 ℃.PNIPAM表现出温度敏感性的原因主要是氢键作用和疏水作用：当温度低于LCST时,分子中的酰胺基团可与水分子形成氢键,嵌段共聚物的溶解性增加,PNIPAM链段得以舒展,呈无规线团状;而当温度升到LCST及以上时,酰胺键与水分子之间的氢键被破坏,PNIPAM链段表现为疏水性,嵌段共聚物胶束粒径变小.疏水链段比例的提高可降低温敏性共聚物的LCST,甚至可能使共聚物的LCST消失[13-14].Ba-10的LCST高于Ba-15,可能是因为Ba-10中的强疏水性单元MAPOSS比例较小;在Ba-20中强疏水性单元MAPOSS是3种嵌段共聚物中所占比例最大的,导致Ba-20的LCST最低.

图9 嵌段共聚物胶束粒径随温度的变化曲线Fig.9 Variation curves of block copolymer micelle size with temperature

图10 不同温度下包芘共聚物胶束对芘的释放比例随时间的变化曲线Fig.10 Variation curves of pyrene release percentage of pyrene-copolymer micells with time at different temperature

图10为27,32和37 ℃下,Ba-10、Ba-15和Ba-20的包芘共聚物胶束对芘的释放比例随着时间的变化曲线,可以看出,Ba-10包芘共聚物胶束在37 ℃时对芘的释放比例明显高于在27和32 ℃时;而Ba-15在32和37 ℃时对芘的释放比例都明显高于27 ℃时;Ba-20在3种不同温度下对芘的释放比例相差不大.由图10得到的结果和3种嵌段共聚物的LCST相符.

在常温下,芘通过扩散效应释放到外部环境中,胶束内外芘的含量差为芘释放动力;同时芘被包裹在疏水核中,扩散到溶液中需要克服疏水内核对芘的作用,并且需要通过胶束的核-壳界面以及亲水性壳层.当温度上升至LCST以上时,胶束表面的亲水壳层的亲水性下降,且胶束内核因为表面壳层的坍塌而收缩变紧,这样就使得芘通往外界的路径缩短,核内的芘被排挤出来,释放到外部溶液中.

3 结 论

本研究采用RAFT成功制备了具有双重响应的POSS基三元嵌段共聚物,并利用DLS、FT-IR、紫外-可见吸收光谱以及荧光光谱等测试手段研究嵌段共聚物在水中的自组装行为与pH响应性和温度响应性.通过改变环境的pH、温度可以有效地控制合成的共聚物胶束的尺寸和稳定性,调节对疏水客体分子的控释作用,特别是在酸性介质中,客体分子能够快速地释放.此外，嵌段共聚物中疏水链段与亲水链段的比例也会影响其CMC及胶束粒径的尺寸,亲水链段比例越大,越有利于客体分子的释放.上述嵌段共聚物纳米粒子的响应特性,使其可作为潜在的药物输送载体.

[1] FENART L,CASANOVA A,DEHOUCK B,et al.Evaluation of effect of charge and lipid coating on ability of 60-nm nanoparticles to cross aninvitromodel of the blood-brain barrier[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,1999,291(3):1017-1022.

[2] YOO H S,LEE K H,OH J E,et al.Invitroandinvivoanti-tumor activities of nanoparticles based on doxorubicin-PLGA conjugates[J].Journal of Controlled Release,2000,68(3):419-431.

[3] MA X,TIAN H.Stimuli-responsive supramolecular polymers in aqueous solution[J].Accounts of Chemical Research,2014,47(7):1971-1981.

[4] SCHMALJOHANN D.Thermo-and pH-responsive polymers in drug delivery[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2006,58(15):1655-1670.

[5] XIA Y,ZENG Y,HU D,et al.Light and pH dual-sensitive biodegradable polymeric nanoparticles for controlled release of cargos[J].Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry,2017,55(10):1773-1783.

[6] WEI H,PERRIER S,DEHN S,et al.One-pot ATRP synthesis of a triple hydrophilic block copolymer with dual LCSTs and its thermo-induced association behavior[J].Soft Matter,2012,8(37):9526-9528.

[7] SAHOO B,DEVI K S,BANERJEE R,et al.Thermal and pH responsive polymer-tethered multifunctional magnetic nanoparticles for targeted delivery of anticancer drug[J].ACS Applied Materials & Interfaces,2013,5 (9):3884-3893.

[8] CUI D,TIAN F,OZKAN C S,et al.Effect of single wall carbon nanotubes on human HEK293 cells[J].Toxicology Letters,2005,155(1):73-85.

[9] KIM S K,HEO S J,KOAK J Y,et al.A biocompatibility study of a reinforced acrylic-based hybrid denture composite resin with polyhedraloligosilsesquioxane[J].Journal of Oral Rehabilitation,2007,34(5):389-395.

[10] YANG C,DENG Y,ZENG B,et al.Hybrid amphiphilic block copolymers containing polyhedral oligomeric silsesquioxane:synthesis,characterization,and self-assembly in solutions[J].Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry,2012,50(20):4300-4310.

[11] CONNAL L A,LI Q,QUINN J F,et al.pH-responsive poly (acrylic acid) core cross-linked star polymers:morphology transitions in solution and multilayer thin films [J].Macromolecules,2008,41(7):2620-2626.

[12] JONES M,LEROUX J.Polymeric micelles:a new gene-ration of colloidal drug carriers[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,1999,48(2):101-111.

[13] POLOZOVA A,WINNIK F M.Contribution of hydrogen bonding to the association of liposomes and an anionic hydrophobically modified poly (N-isopropylacrylamide)[J].Langmuir,1999,15:4222-4229.

[14] KOGA S,SASAKI S,MAEDA H.Effect of hydrophobic substances on the volume-phase transition of N-isopropyl-acrylamide gels[J].The Journal of Physical Chemistry B,2001,105:4105-4110.