中空羟基磷灰石/rhBMP-2人工骨治疗骨缺损对血清碱性磷酸酶的影响

董章庆 涂建龙 熊龙 许振波 周铨昆 蔡敏 吴唯

骨缺损的治疗是临床医师研究的热点, 比如如何缩短骨缺损的愈合时间、减少骨不连的发生等。本课题组前期成功制备了表面多孔、内部中空的羟基磷灰石微球, 并通过压力渗透的方法将rh BMP-2装载到中空微球中, 证实了其在体外具有缓释行为, 并对所释放生长因子的活性进行了评价［1-3］。作者拟建立新西兰兔骨缺损模型, 观察植入中空羟基磷灰石/ rhBMP-2人工骨后在骨折愈合过程中对血清碱性磷酸酶的影响, 为中空羟基磷灰石/rhBMP-2人工骨修复骨缺损提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源 选取24只成年新西兰兔制作胫骨缺损模型,雌雄不拘(昆明医科大学实验动物中心), 体重2.8～3.0 kg。随机分为复合组、单纯组与对照组, 每组8只。新西兰兔喂养在室温20℃、相对湿度50%～70%的环境中, 自由饮水、进食。

1.2 实验材料及主要试剂 本课题组前期制备了表面多孔、内部中空的羟基磷灰石微球, 通过压力渗透的方法将rh BMP-2装载到中空微球中, 直径0.5～0.7 cm, 灭菌处理后备用。碱性磷酸酶体外临床试剂盒购自北京中生生物工程高技术公司。

1.3 方法

1.3.1 制备骨缺损动物模型 绑定实验动物。用10%水合氯醛溶液按3 ml/kg的剂量行腹腔麻醉。后腿脱毛, 常规消毒,手术铺巾。逐层切开显露胫骨, 在胫骨前外侧中段钻孔, 直径0.8 cm, 复合组将中空羟基磷灰石/ rhBMP-2人工骨植入缺损处；单纯组植入单纯中空羟基磷灰石人工骨；对照组不植入任何材料。创面用生理盐水冲洗, 逐层缝合后包扎。不作局部内、外固定, 伤口不拆线, 让缝线自行脱落。术后立即肌内注射80万单位青霉素, 连用3 d。麻醉清醒后常规喂养,自由活动, 密切观察兔的饮食、活动及伤口反应。

1.4 观察指标 观察三组手术效果, 比较三组术前及术后4、8、12、16周血清碱性磷酸酶活性检测结果, 分别于术前,术后4、8、12、16周每周第1天上午8:00抽取新西兰兔静脉血,检测其碱性磷酸酶活性。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用 t检验P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 手术效果 三组均未发生全身异常反应。伤口无感染,愈合良好, 缝线自行脱落。

2.2 各时间段血清碱性磷酸酶活性检测结果 术后4、8周三组碱性磷酸酶较术前显著增高, 术后8周达最高峰, 之后又逐渐下降。术前三组血清碱性磷酸酶活性检测结果比较差异无统计学意义(P＞0.05)。术后4、8、12、16 周复合组血清碱性磷酸酶活性检测结果(109.96±8.98)、(131.37±10.64)、(90.14±6.71)、(60.28±3.76)U/L高于单纯组的 (82.47±5.32)、(101.07±4.59)、(65.60±4.59)、(56.03±3.75)U/L, 高于对照组的 (70.940±4.01)、(87.37±3.31)、(57.42±4.48)、(52.43±2.36)U/L, 且单纯组高于对照组, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 三组各时间段血清碱性磷酸酶活性检测结果比较( x-±s, U/L)

3 讨论

3.1 中空羟基磷灰石可作为理想载体 有研究报道［4-6］, 无机材料特别是中空羟基磷灰石具有优良的生物相容性、力学性能、生物活性和骨传导性, 且能与人体骨组织形成良好的骨性键合, 因而被视为一种理想的支架材料, 其中纳米羟基磷灰石曾被认为是理想的载体［6］, 但其突释效应限制了临床应用。本实验通过使用表面多孔且中空的羟基磷灰石微球作为缓释载体, 装载rhBMP-2, 构建了中空羟基磷灰石/ rhBMP-2 复合人工骨与不装载rhBMP-2 的单纯中空羟基磷灰石人工骨, 分别植入到兔胫骨缺损处, 结果证明中空羟基磷灰石是rhBMP-2 较为理想的载体, 具体原因为①中空羟基磷灰石最接近天然的骨组织结构, 有利于细胞较好地吸附。②中空羟基磷灰石具有空腔、内表面、微孔等多级吸附结构, 可以起到很好的缓释作用［3］, 发挥持续促进成骨的效应。③中空羟基磷灰石微球在体液环境中可缓慢降解, 可实现rhBMP-2的持续、长期释放。

3.2 中空羟基磷灰石/ rhBMP-2 复合人工骨的优势 ①生物相容性很好, 体内可以降解吸收；②释放周期长, 避免突释效应；③生物力学性能强, 具有优异的骨传导性能；④可以促进骨缺损区发生再血管化, 利于骨缺损的修复［7,10］；⑤来源广泛, 可以批量生产。因此, 中空羟基磷灰石/ rhBMP-2复合人工骨材料具有非常大的应用前景, 有着极其重要的经济和社会价值。

3.3 碱性磷酸酶活性检测的意义 碱性磷酸酶主要由成骨细胞和骨细胞分泌。机体内碱性磷酸酶的活性在rhBMP-2的刺激下会提高, 这是成骨的一个比较典型的标志, 是反应骨及软骨细胞的增生程度及活跃程度的良好指标。本实验中复合组和单纯组的碱性磷酸酶活性均高于对照组, 且复合组高于单纯组, 差异有统计学意义(P＜0.05), 植入后4 周增生活跃, 8 周时达最高峰, 说明中空结构有利于成骨, 机制可能在于中空结构时成骨面积增大, 其胶原和明胶成分可保持rhBMP-2, 延缓并使其持续释放。

综上所述, 中空羟基磷灰石/ rhBMP-2可提高骨缺损碱性磷酸酶活性, 有效促进骨缺损修复。

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