利用SSR标记分析东北野生菰遗传多样性和遗传结构

苏晓娜，王惠梅，黄雪雯，谢小燕，张孝天，牛 恋，董 琳，江绍琳，吴建利*，江绍玫

(1.江西农业大学南昌商学院，江西 南昌 330013；2.中国水稻研究所，浙江 杭州 310006；3.黔南民族师范学院，贵州 都匀 558000；4.江西财经大学 艺术学院，江西 南昌 330013；5.江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045；6.江西财经大学 统计学院，江西 南昌 330013)

菰属植物，在分类学上属禾本科，水稻的近缘属之一[1-2]。菰属在全球共有4种，分别为水生菰(Zizaniaaquatica)，菰(Zizanialatifolia)，沼生菰(Zizaniapalustris)和得克萨斯菰(Zizaniatexana)。除菰分布于东亚地区外，其他3个种均分布于北美洲。作为菰属4种之一的中国菰(Z.latifolia)，属多年生水生草本植物，其对生境和生态习性的要求均类似于水稻，且具有水稻所不具备的多种优良性状，在扩大和丰富水稻育种基因库方面具有重要的研究价值[3-4]，被许多育种家认为是水稻育种优异外缘基因的重要来源[5]。野生菰可开花结实，果实颖果称为菰米，成熟后易落粒。若在菰拔节抽穗时，接触到黑粉菌(Ustilagoescullenta)，菌丝就会入侵到花茎薄壁组织内，刺激其生长，使其幼茎基部膨大成柔软可食的纺锤形组织，被称作“菰手”或“茭白”，此后植株也失去了开花结实的能力。目前，茭白已成为种植面积仅次于莲藕的十二种水生蔬菜之一[6]。

当前分子标记技术在植物遗传多样性研究中起着极为重要的作用[7]。植物材料在不同分子标记作用下，会表现出不同的特性，因而只有选用理想的标记才能更为客观、准确的反应植物的遗传多样性[8]。理想的分子标记应具有对基因组取样无偏离、共显性、对变异的检测分辨率高以及不受环境条件直接影响等特点[9]。SSR分子标记，是目前应用最为广泛的分子标记技术之一，具有理想分子标记绝大多数优良特点，广泛应用于农作物的基因组学和遗传育种学研究[10]。

近年来，国内外对菰属植物的关注度日益提高[11-14]，本研究采用SSR分子标记技术，借助POPGENE、STRUCTURE、ARLEQUIN、MEGA及MVSP等统计分析软件，对我国东北地区5个野生菰居群进行遗传多样性和遗传结构分析，以期完善我国野生菰资源基础信息资料，为该物种的保护、种质利用及进化分析提供借鉴。同时，对植物群体遗传学研究领域中极为重要的分析软件的数据录入格式、软件操作方法进行了详细说明，以期为相关领域的研究者提供清晰、完整、可操作规程。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2016—2017年进行。供试材料共98株，来自于东北地区(大连、沈阳、齐齐哈尔、佳木斯与通化)的5个野生菰居群(表1)。取样量依据居群的现有分布规模而定，各样本间距不得小于10 m，每株约采集幼叶35片，并立即放入装有硅胶干燥剂的塑封袋中快速干燥，后带回杭州富阳市中国水稻研究所实验室-80 ℃冰箱保存，用于DNA提取备用。

表1 供试菰材料地理信息概况Tab.1 Geographic information of Zizania latifolia materials

1.2 DNA 提取和 SSR-PCR

菰干燥叶片基因组提取采用简易提取法[15]，所得DNA经紫外分光光度计检测质量和浓度后，用ddH2O稀释至终浓度为20 ng/μL，-20 ℃保存备用。PCR扩增反应条件，经过比较和优化，确定为10 μL的反应体系，内含模板DNA 1.0 μL，10 μmol/L正反向引物各1.0 μL，2×Specific TMTaqMaster Mix 5.0 μL，ddH2O 2.0 μL。扩增程序为94 ℃预变性3 min，接着94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。从已报道的24对菰SSR标记，其中16对基于菰(Z.latifolia)基因组开发[16]，另外8对标记基于得克萨斯菰(Z.texana)基因组开发[17-18]，筛选出7对SSR标记应用于本研究，分别是ZM5、ZM13、ZM26、ZM28、ZM30、ZM44[16]和Zt-23[18]。引物ZM44和Zt-23对36份野生菰材料的扩增效果见图1。

1-36:随机抽取的36份菰个体样本的扩增结果1-36:Amplification results of 36 random selected Z.latifolia individuals图1 引物ZM44、Zt-23对36份菰种质的PCR扩增图谱Fig.1 PCR amplification of 36 Z.latifolia individuals using primer ZM44 and Zt-23

1.3 数据分析

以稳定清晰的扩增条带在相同电泳迁移位置出现的有无记数，有带记为“1”，无带记为“0”，构建二元数值矩阵统计数据库。通过POPGENE软件对扩增条带进行遗传多样性的相关参数分析[19]；运用MVSP软件的主成分分析(PCA)对各居群的遗传关系进行聚类；采用STRUCTURE软件对东北野生菰居群的遗传结构进行分析[21]；借助 ARLEQUIN软件中的AMOVA分析，对东北野生菰居群的分布及遗传分化进行检测[22]；运用TFPGA软件进行遗传距离与地理距离相关性检测；采用 UPGMA法，通过MEGA和POPGENE软件，绘制东北野生菰居群聚类图[23]。

1.3.1 POPGENE数据录入及软件操作方法 数据格式的正确编辑是保障分析顺利进行的前提，数据格式上的任何微小错误都将导致文件无法导入软件或出现错误分析结果。首先，在EXCLE里构建0/1二元矩阵数据库(附图1为大连、沈阳数据)。第一列为居群代码，第二列为单株编号，首行数字表示7个标记共获得了64条扩增条带。构建结束后，将EXCLE里的数据整理成附图2中TXT文档格式，用于之后的 POPGENE 软件分析。

先在计算机D盘中新建一个文件夹“A”用以储存分析结果，将待分析文件“B”存入文件夹“A”中。打开菜单中File,点击Load data并选择dominate marker data(可根据自己的数据需要进行设置)，将数据“B”导入软件。回到主菜单窗口，点击Dominant，根据数据类型选择Haploid或Diploid(菰为二倍体，故选择Diploid)，在 check all选项上打勾，点击OK，接下来全部点“是”，分析结束后界面会自动关闭，其分析结果会自动保存于“A”文件夹中。查看分析结果需重新打开软件，具体步骤为：file→load data→dominate marker data→“A”文件夹→.rst文件。

1.3.2 MVSP数据录入及软件操作方法 MVSP数据格式较为简单，在EXCLE里进行编辑，第一列为单株编号，第二列为居群代码，第三列之后为0/1二元数值矩阵(附图3)。

首先，将整理好的数据导入MVSP软件中，点击File→Import→EXCLE数据→Open→OK即可完成数据导入。返回主菜单窗口，对数据进行分组，点击Date→Edit date→Date→Add Groups，分组完成后即可进行数据分析。点击Analyses→Principal Component Analysis，弹出对话框，选择数据中心化Center date，点击OK即可完成分析。点击Graphs下拉菜单中的Scatter plot，点击OK，即可查看主成分分析聚类图，最后根据需要对图片进行美化与编辑。在此，要特别提醒使用者，在运用MVSP软件做主成分分析时，最需要引起注意的就是数据导入之后，要对数据进行二次分组编辑，否则将导致主成分分析图无法进行不同居群的颜色及图形的编辑。

1.3.3 STRUCTURE数据录入及软件操作方法 在记事本中进行基因型数据编辑(数据格式见附图5)。第1列为样品代码，第2列之后，为每一样本在不同标记下的基因型代码，每个单株重复编辑一次。

打开 Structure 软件，选择 File菜单下的子菜单New Project，在弹出的对话框中，对应填入文件名、存放路径和分析文件，点击Next。弹出第二个对话框中需要填入待分析样品数量、单倍体或二倍体以及标记数量，完成后点击Next。第三个对话框选择默认格式直接点击NEXT，第四个对话框勾选第一个Individual ID for each individual，其余选项均不选择，点击Finish，第五个对话框直接点击Proceed即可完成文件导入。接下来进行数据分析操作。回到主菜单，选择Parameter set中的new选项，此时会出现一个对话框，在Run length界面中length of burnin peroid及Number of MCMC Reps after burnin均填写10000，对于该对话框中的Ancestry Models，Allele frequency model，Advanced界面选项均选 Default setting，完成操作后，回到Run length界面点击OK选项后会出现一个对话框，输入文件名A并点击确定，运行完毕后将产生一个由A命名的文件夹以保存运算结果和绘图结果。点击Project的下拉菜单中的Start a job，单击选中命名的文件夹A，设置 K 从 2 到 5 等，其它不选，点击Start即可进行分析。分析完成后，将分析结果文件进行压缩，后通过http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/网页进行运算，计算ΔK值。根据计算的K值，点击右边子窗口中的Bar plot，即可查看准确的遗传结构图。

1.3.4 ARLEQUIN数据录入及软件操作方法 按照格式编辑数据文件，此文件以Excel编辑，保存为文本，但将.txt改为.arp。数据格式见附图4。打开软件，点击open project 导入待分析数据，点击Settings键，勾选AMOVA菜单内所有内容，最后点击Start即可获分析结果。

1.3.5 MEGA数据录入及软件操作方法 数据格式见附图6。打开软件，点击File菜单下的Open date，选择待分析文件，并在出现的新窗口中点击Pairwise distance及OK即可完成数据导入。返回主菜单界面，选择Phylogeny的下拉菜单Construct Phylogeny中的UPGMA 法，最后点击Compute即可完成聚类图构建。

2 结果与分析

2.1 东北野生菰的遗传多样性

从24对菰SSR标记中筛选出7对扩增条带数丰富、多态性条带比率高和重复性好的SSR标记，对来自东北地区的5个野生菰居群共98份样本材料进行PCR扩增分析。

POPGENE软件分析结果(表2)显示：在物种水平上，东北地区野生菰多态性条带百分率(PPB)为 71.88%；等位基因数(Ao)和有效等位基因数(Ae)分别为1.719和1.332；Nei’s基因多样性指数与Shannon’s多样性信息指数相对较高，分别为0.201和0.313，表明东北地区野生菰具有较为丰富的遗传多样性。在居群水平上，各居群遗传多样性差异较大。通化、佳木斯、沈阳居群遗传多样性相对较高，分别为43.75%、42.19%、37.50%；齐齐哈尔和大连居群偏低，分别为15.62%和12.50%。

POPGENE软件的另一组分析结果表明，居群间基因多样性(Ht) 为0.223，居群内基因多样性(Hs)为0.102，遗传分化值(Gst)为0.543，表明东北野生菰遗传变异主要存在于居群间占54.3 %，居群内占45.7 %。居群间平均基因流Nm为0.421(Nm<1)，Wright[24]认为：当Nm>1时，基因流可以防止由遗传漂变而引起的群体间的遗传分化，在本研究中Nm<1，说明遗传漂变在东北野生菰的遗传分化中起一定的作用。

表2 东北地区5个野生菰居群的遗传多样性分析Tab.2 Genetic diversity of 5 Z.latifolia populations in Northeast China

2.2 东北野生菰的遗传结构

遗传距离(GD)和遗传相似系数(GS)是衡量居群间遗传分化程度最重要的指标。分析结果(表3)显示，供试材料各居群间的遗传相似性系数和遗传距离分别介于0.605 5～0.955 6和0.045 4～0.501 6。遗传距离最小为0.045 4，来自居群JMS与TH，其遗传相似度最高为0.955 6，表明这2个居群的遗传亲缘关系最近；而居群DL与QQHE的遗传距离最大为0.501 6，其遗传相似度最低为0.605 5，表明这2个居群亲缘关系最远。

表3 东北地区5个野生菰居群的遗传相似性系数和遗传距离Tab.3 Genetic similarity coefficient and genetic distance of 5 Z.latifolia populations in Northeast China

AMOVA分析结果表明(表4)，东北野生菰居群的遗传变异较多的来自于居群间(占53.43 %)，居群内的变异占46.57%；相比较而言，居群间具有更高的遗传分化水平(FST=0.534)。同时，从侧面也反映出东北野生菰具有较强的环境适应能力，以及良好的产生新突变、适应新环境的基因基础和遗传进化潜力，对野生菰的长期生存与应用推广极为有利。

表4 东北地区5个野生菰居群的分子变异分析(AMOVA)结果Tab.4 Analysis of molecular variance within/among 5 Z.latifolia populations in Northeast China

图2 Deltak 值折线图 Fig.2 Deltak value line chart

STRUCTURE软件分析结果(图2、图3)显示，ΔK峰值出现在3，暗示来自东北地区大连(DL)、沈阳(SY)、齐齐哈尔(QQHE)、佳木斯(JMS)、通化(TH)5个居群的98个野生菰样本遗传结构可以大致分为3组(用3种不同的颜色来表示)。从图中可以看出，大连(DL)居群较其他居群遗传结构明显不同，沈阳(SY)居群遗传结构一致，齐齐哈尔(QQHE)、佳木斯(JMS)和通化(TH)居群遗传结构混杂较为明显。

2.3 聚类结果

利用MVSP软件基于二元数据对东北地区野生菰群体进行主成分分析，前3个特征根的累积贡献率分别为57.30%、72.73%、79.54%。将东北野生菰群体构建第一、二主成分的二维坐标图(图4)。从图中可以看出，第一主成分明显将大连(DL)居群独立出来，齐齐哈尔(QQHE)居群基本聚为一起，其他3个居群(JMS、TH、SY)的大部分个体聚在一起。采用UPGMA法，通过MEGA和POPGENE软件，对东北野生菰居群进行聚类分析，从而对各居群间的遗传关系进行研究。结果如图5和图6所示：佳木斯(JMS)、通化(TH)及沈阳(SY)居群共聚为第一类，其中佳木斯(JMS)、与通化(TH)居群的遗传距离最小；而齐齐哈尔(QQHE)和大连(DL)居群间遗传距离最大，在聚类上表现为各自聚为一类。通过TFPGA软件进行遗传距离和地理距离相关性检测，其结果表明：东北野生菰居群间不存在明显的亲缘地理关系(r=0.903 7，P=0.812 0，P>0.05，说明无相关性)。

DL(1～15),SY(16～36),QQHE(37～52),JMS(53～75),TH(76～98)图3 K=3时贝叶斯聚类法分析结果Fig.3 Histogram based on bayesian analysis with K=3 using STRUCTURE

图4 东北地区5个野生菰居群的主成分(PCA)分析Fig.4 PCA analysis of 5 Z.latifolia populations in Northeast China

图5 MEGA基于SSR标记的东北地区5个野生菰居群的UPGMA聚类分析Fig.5 UPGMA clustering for 5 Z.latifolia populations in Northeast China based on SSR markers

图6 POPGENE基于SSR标记的东北地区5个野生菰居群的UPGMA聚类分析Fig.6 UPGMA clustering for 5 Z.latifolia populations in Northeast China based on SSR markers

3 讨 论

3.1 东北野生菰的遗传多样性和遗传结构

本文对东北地区的5个野生菰居群，共98个样本的遗传多样性进行分析，结果显示：东北野生菰在物种水平上具有较高的遗传多样性，其多态位点百分率达71.88%。从地域分布来看，通化(TH)、佳木斯(JMS)、沈阳(SY)居群的遗传多样性偏高，分别为43.75%、42.19%、37.50%；齐齐哈尔(QQHE)和大连(DL)居群偏低，分别为15.62%和12.50%。Nei’s 基因多样性指数(He)和 Shannon’s 信息指数(I)也是评价遗传多样性的重要指标。本研究中5个野生菰居群的Nei’s基因多样性指数与Shannon’s多样性信息指数相对较高，分别为0.201和0.313，同样显示东北地区野生菰具有较为丰富的遗传多样性。

结合前人研究结果可知，不仅在东北地区的野生菰具有较高的遗传多样性，在华中、西南、鄱阳湖等地区乃至全国的野生菰均表现出了较高的遗传多样性。例如，Xu等[11]以Adh1a基因序列为标记，对来自我国16个省区的21个菰居群遗传多样性及遗传结构进行研究，结果表明，各居群间存在不同程度的核苷酸差异，东北地区目标基因序列变异最大，但各居群未形成明显的亲缘地理结构，这与本研究结果完全一致。Chen等[12]采用10对SSR标记对我国华中地区7个菰居群居群进行了遗传多样性和遗传结构分析，结果显示，该流域居群间遗传差异较小，且多数居群表现出突变-漂变不平衡，提示该物种近年可能存在种群数量的锐减，从而使得遗传多样性受影响。而本次对东北地区野生菰种质资源进行生境踏查时发现，东北地区的野生菰居群也面临消亡的危险，亟待对其展开保护与研究。王惠梅等[5]基于SSR和ISSR 2种分子标记技术，对鄱阳湖流域的野生菰资源遗传多样性进行研究，2种标记均检测到该流域野生菰表现出较高的遗传多样性，其中SSR标记检测到的多态位点几率为91.32%，ISSR为78.25%；黄雪雯等[25]对我国西南地区的野生菰遗传多样性研究结果中，同样表明该地区野生菰有着丰富的遗传多样性，各居群的聚类结果与地理分布也无明显相关性。

反映遗传结构的另一个重要参数指标就是遗传分化系数。本文研究结果表明，东北野生菰居群的遗传变异较多的来自于居群间，具有更高的遗传分化水平(FST=0.534)。这一结果与Xu等[11]利用核Adh1a基因序列对中国野生菰的研究结果类似，但与Chen等[12]对华中地区长江流域野生菰的研究结果存在明显差异，其结果显示该流域居群间固定指数低(FST=0.098)，遗传差异小，推测可能与采样地不同有关。影响遗传分化的因素很多，基因流便是其中之一。本次研究结果表明，影响东北地区5个居群遗传结构的主导因素很可能是由于居群间存在一定的基因交流(Nm=0.421,Nm<1)。众所周知，物种并非一成不变，在长期的种族延续过程中，必然会发生无数次基因间的相互交流。由于菰为挺水性植物，且本次采集的东北野生菰样本均来自人迹罕至的河流、胡泊或湿地，因而水流成为影响各居群间基因交流的重要原因，这一点在Chen和Xu的研究中也有类似推测。

3.2 选用适当软件进行数据分析

POPGENE和ARLEQUIN软件均可以进行遗传变异分析，常用这2种软件分析同一组数据，再对结果进行比较，相互检验，以确保分析结果的可靠性。从本文分析结果来看，POPGENE和ARLEQUIN软件的分析结果一致，均显示东北地区野生菰的遗传变异主要存在于居群间。与ARLEQUIN软件相比，POPGENE对数据要求更为严格，任何偏差都可能导致数据导入失败，并且不易检查出错误所在。因此，在进行遗传变异分析时，更多学者选择使用ARLEQUIN软件。但是，POPGENE软件的重要性不会因数据录入难度高而被削弱。因为，它不仅可以进行遗传变异分析，还可以获取多个遗传多样性参数(表2)及遗传距离与相似度(表3)等，同时还可采用UPGMA绘制基于Nei’s遗传距离的树形图(图6)。只需将正确的数据导入软件，便可获得一系列分析结果，而无需要针对不同分析目的构建不同数据格式，这是POPGENE之所以成为目前研究者分析遗传多样性最普遍采用的软件主因。

POPGENE、MEGA以及Ntsys软件均可用于聚类分析，但Ntsys软件的分析结果可靠性略低，因而建议选择前2种软件进行分析。从本研究表明，POPGENE与MEGA软件分析结果一致，均将东北野生菰居群聚为3类。从操作简便性而言，MEGA软件优于POPGENE，因它包含不同数据格式转换功能，只需将遗传距离值输入软件即可构建树状图，提高了软件的通用性[17]。POPGENE与 MVSP软件一样，需构建好复杂的数据库后，才可进行相应的参数分析。

附图1 0/1二元矩阵Supplementary fig.1 0/1 matrix

附图2 Popgene 数据格式Supplementary fig.2 Popgene date format

附图3 主成分分析(PCA)数据格式Supplementary fig.3 PCA analysis of date format

附图4 分子方差分析(AMOVA)数据格式Supplementary fig.4 AMOVA date format

附图5 STRUCTURE数据格式Supplementary fig.5 STRUCTURE date format

附图6 MEGA数据格式Supplementary fig.6 MEGA date format

参考文献：

[1] 陈守良,徐克学.菰属ZizaniaL.植物的分支分类研究[J].植物研究,1994,14(4):385-93.

Chen S L,Xu K X.A study on cladistic taxonomy ofZizaniaL.(Gramineae)[J].Bulletin of Botanical Research,1994,14(4):385-393.

[2] Terrell E E,Peterson P M,Reveal J L,et al.Taxonomy of north american species ofZizania(Poaceae)[J].Sida Conteib Bot,1997,17(3):533-549.

[3] 王晓丽,马建,孙长占等.菰在水稻育种中的研究进展[J].吉林农业科学,2006,31(1):35-36.

Wang X L,Ma J,Sun C Z,et al.The research advance ofZizaniaL.in rice breeding[J].Journal of JiLin Agricultural Sciences,2006,31(1):35-36.

[4] 沈玮玮,宋成丽,陈洁等.转菰候选基因克隆获得抗白叶枯病水稻植株[J].中国水稻科学,2010,24(5):447-452.

Shen W W,Song C L,Chen J,et al.Transgenic rice plants harboring genomic DNA fromZizanialatifoliaconfer bacterial blight resistance[J].Chin J Rice Sci,2010,24(5):447-452.

[5] 王惠梅,吴国林,黄奇娜，等.基于SSR和ISSR鄱阳湖流域野生菰(Zizanialatifolia)资源的遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报,2015,16(1):133-141.

Wang H M,Wu G L,Huang Q N,et al.Genetic diversity ofZizanialatifoliaGriseb (Turcz) from Poyang Lake Basin based on SSR and ISSR analysis[J].Journal of Plant Genetic Resources,2015,16(1):133-141.

[6] Guo H B,Li S M,Peng J,et al.ZizanialatifoliaTurcz.cultivated in China[J].Genetic Resources and Crop Evolution,2007,54(6):1211-1217.

[7] 李永祥,李斯深,李立会，等.披碱草属12个物种遗传多样性的ISSR和SSR比较分析[J].中国农业科学,2005,38(8):1522-1527.

Li Y X,Li S S,Li L H,et al.Comparison of genetic diversity of twelveElymusspecies using ISSR and SSR markers[J].Scientia Agricultura Sinica,2005,38(8):1522-1527.

[8] 李鸿雁,李志勇,师文贵，等.3种生态型野生扁蓿豆种质资源ISSR与SSR遗传多样性分析[J].草业学报,2012,21(5):107-113.

Li H Y,Li Z Y,Shi W G,et al.The genetic diversity of three ecologicalMedicagoruthenicagermplasms revealed by ISSR and SSR[J].Acta Prataculturae Sinica,2012,21(5):107-113.

[9] 钱韦,葛颂,洪德元.采用RAPD和ISSR标记探讨中国疣粒野生稻的遗传多样性[J].植物学报,2000,42(7):741-750.

Qian W,Ge S,Hong D Y.Assessment of genetic variation ofOryzagranulatadetected by RAPDs and ISSRs[J].Acta Botanica Sinica,2000,42(7):741-750.

[10] 廖娇,黄春辉,辜青青，等.猕猴桃EST-SSR引物筛选及通用性分析[J].果树学报,2011,28(6):1111-1116.

Liao J,Huang C H,Gu Q Q,et al.Mining and transferability analysis of EST-SSR primers in Kiwifruit (Actinidiaspp.)[J].Journal of Fruit Science,2011,28(6):1111-1116.

[11] Xu X W,Ke W D,Yu X P,et al.A preliminary study on population genetic structure and phylogeography of the wild and cultivatedZizanialatifolia(Poaceae) based on Adh1a sequences[J].Theor Appl Genet,2008,116(6):35-43.

[12] Chen Y Y,Chu H J,Liu H,et al.Abundant genetic diversity of the wild riceZizanialatifoliain central China revealed by microsatellites[J].Annals of Applied Biology,2012,161(2):192-201.

[13] Xu X W,Wu J W,Qi M X,et al.Comparative phylogeography of the wild-rice genusZizania(Poaceae) in eastern Asia and North America[J].American Journal of Botany,2015,102(2):239-247.

[14] Li J Q,Guo Y S,Franois R.Environmental hetetogeneity and population variability of sclerophyllous oaks (Quercussuber) in east Himalayan region[J].Forestry Studies in China,2000,2(1):1-15.

[15] 奉保华.水稻淡褐斑叶突变体lbsl1的鉴定、遗传分析与基因定位[D].北京：中国农业科学院,2012:27-28.

Feng B H.Characterization,genetic analysis and gene mapping of a light brown spotted leaf mutant in rice[D].Beijing:China Agricultural National Institute,2012:27-28.

[16] Quan Z,Pan L,Weidong K,et al.Sixteen polymorphic microsatellite markers fromZizanialatifoliaTurcz.(Poaceae)[J].Molecular Ecology Resources,2009,9(3):887-889.

[17] Richards C M,Reilley A,Touchell D,et al.Microsatellite primers for Texas wild rice (Zizaniatexana),and a preliminary test of the impact of cryogenic storage on allele frequency at these loci[J].Conservation Genetics,2004,5(6):853-859.

[18] Christophem R,Michaelf A,Ann R,et al.Capturing genetic diversity of wild populations for ex situ,conservation:Texas wild rice (Zizaniatexana) as a model[J].Genetic Resources and Crop Evolution,2007,54(4):837-848.

[19] Yeh F,Yang R C,Boyle T.Popgene:Microsoft window-based freeware for population genetic analysis,version1.31[J].Edmonton:University of Alberta,1999.

[20] Pritchard J K,Stephens M,Donnelly P.Inference of population structure using multilocus genotype data[J].Genetics,2000,155(2):574-578.

[21] Evanno G,Regnaut S,Goudet J.Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE:a simulation study[J].Molecular Ecology,2005,14(8):2611-2620.

[22] Excoffier L,Laval G,Schneider S.Arlequin (version 3.0):an integrated software package for population genetics data analysis[J].Evolutionary Bioinformatics,2005,1(4A):47-50.

[23] Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.2007.MEGA4：Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0[J].Molecular Biology and Evolution，2007,24 (8)：1596-1599.

[24] Wright S.Evolution in Mendelian populations[J].Genetics,1931,16(2):97-159．

[25] 黄雪雯,王惠梅,苏晓娜,等.基于SSR的西南地区野生菰资源遗传多样性及遗传结构分析[J].江西农业大学学报,2017,39(2):409-418.

Huang X W,Wang H M,Su X N,et al.Genetic diversity and genetic structure ofZizanialatifoliaGriseb (Turcz) from southwest China based on SSR analysis[J].Acta Agriculturae Universitis Jiangxiensis,2017,39(2):409-418.