β连环蛋白对脑胶质瘤辐射抗性的影响

高力扬，李锦宏，陈兵，杨帆，岑学程，廖壮槟，龙霄翱，王思捷

（1.宁夏大学 生命科学学院，宁夏 银川 750021；2.广东医科大学附属医院 神经外科，广东 湛江 524001；3.广东医科大学附属医院 临床研究中心，广东 湛江 524001）

胶质瘤占脑部恶性肿瘤的60%，世界卫生组织神经系统肿瘤分级将其分为低级别和高级别，高级别胶质瘤中位生存时间只有10～15个月。胶质瘤主要的治疗手段是最大安全范围内手术切除肿瘤[1]。由于胶质瘤具有侵袭性的自然特性，手术治疗后必须行放化疗。放射治疗致力于控制或者杀灭术后残留的肿瘤细胞，而化学药物治疗带来的损伤和肿瘤辐射抗性影响其疗效[2]。目前研究发现一些细胞信号通路可能参与胶质瘤辐射抗性[3-6]。因此研究胶质瘤辐射抗性产生的机制对当前临床治疗有重要意义。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

细胞增殖检测试剂盒（cell counting Kit-8,CCK-8）（上海碧云天生物技术研究所），IWR-1-endo抑制剂（美国Selleck Chemicals公司），双抗含青霉素、链霉素购于美国Hyclone公司，胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle medium,DMEM）购于美国Gibco公司，巢蛋白（Nestin）、β微管蛋白Ⅲ（β-tubulin Ⅲ）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）、CD133及Ki-67抗体购于北京中杉金桥公司。德国Leica公司的DMI3000B荧光显微镜、日本电子株式会社的JEM-1400+GATAN CCD832投射电子显微镜由广东医科大学附属医院临床研究中心提供，瑞典Eleketa公司的直线加速器由广东医科大学附属医院放疗科提供。

1.2　方法

1.2.1U87细胞系的培养及诱导人脑胶质瘤U87细胞株复苏后，加入含有双抗（青霉素50μ/ml，链霉素50 mg/ml）和10% FBS的DMEM高糖型培养基悬浮细胞，置于37℃、5%二氧化碳CO2培养。待细胞进入对数培养期后，取1/3细胞进行传代培养，或者取1×106个细胞加入1 ml冻存液（80%完全培养基+100μl FBS+100μl二甲基亚砜）于-80℃超低温冰箱中短期冻存。用浓度为5μmol/L的Wnt信号通路抑制剂IWR-1-endo处理细胞2 d，收集细胞用于后续检测。

1.2.2细胞增殖实验采用CCK-8检测细胞增殖情况。消化收集对照组、照射组和IWR-1-endo联合照射组细胞，调节细胞密度为15 000个/ml，取100μl细胞培养于96孔板中。48 h后，每孔加入10μl CCK-8，放置于细胞培养箱培养2～4 h，测定450 nm处吸光度值，并利用细胞生长曲线计算各组贴壁细胞数。

1.2.3平板克隆形成实验0.25%胰蛋白酶分别消化对照组、照射组和IWR-1-endo联合照射组，将3组细胞分别计数，按500个/皿的密度接种细胞于60 mm培养皿中，静置培养1周。待培养皿中出现肉眼可见的克隆时，无水甲醛固定细胞30 min，除去固定液后加入结晶紫染色10 min，用流水温和洗脱染色液，倒置干燥培养皿。肉眼计算细胞克隆数，以克隆形成率表示细胞生长情况，克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.4细胞免疫荧光染色将细胞接种于24孔板培养，IWR-1-endo处理2 d后，用磷酸盐缓冲溶液漂洗细胞，4%多聚甲醛固定30 min，10%聚乙二醇辛基苯基醚通透后加入10%羊血清的封闭液处理30 min，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温下孵育2 h后加入4，6-联脒-2-苯基吲哚核染，于DMI3000B荧光显微镜下观察拍照。Nestin、GFAP、β-tubulin Ⅲ、CD133及Ki-67抗体用于人胶质瘤U87细胞的鉴定。

1.2.5细胞放疗抵抗实验采用直线加速器X射线照射，照射剂量率为4 Gy/min。取对数生长期细胞，于100 mm培养皿中培养48 h后进行放射实验。实验分为对照组和照射组，照射组照射剂量为4 Gy。照射后更换细胞培养液，12 h后收集细胞进行检测。

1.2.6透射电镜4%异丙酮固定细胞后环氧树脂包埋切片，甲苯胺蓝染色，铜网法JEM-1400+GATAN CCD832投射电子显微镜观察细胞。

1.2.7蛋白提取取培养48 h后细胞，添加1 mmol/L苯甲基磺酰氟的细胞裂解液裂解细胞，并用细胞刮刀收集裂解液于1.5 ml离心管中。充分溶解后，10 319 r/min离心5 min，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，组间比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　人脑胶质瘤U87细胞的鉴定

为验证U87细胞具有神经干细胞、神经元及神经胶质细胞等多种特性，而且有较强的增殖活性，笔者选取神经上皮干细胞标志物Nestin、神经胶质细胞标志物GFAP、神经元标志物β-tubulin Ⅲ、干细胞和胶质瘤标志物CD133及增殖细胞相关核抗原Ki-67对人脑胶质瘤U87细胞进行鉴定（见图1）。

2.2　辐射处理后U87细胞中β-catenin的表达

分别提取照射组和对照组细胞中的蛋白，用Western blot检测细胞中β-catenin的表达，并使用Image J软件进行灰度分析。对照组β-catenin蛋白相对表达量为（0.414±0.012），照射组β-catenin蛋白的相对表达量为（0.097±0.003），经t检验，差异有统计学意义（t=24.420，P=0.000），照射组β-catenin蛋白相对表达量降低（见图2）。

2.3　抑制β-catenin对细胞辐射抵抗的影响

用5μmol/L浓度的IWR-1-endo处理U87细胞进行辐射实验。CCK-8细胞增殖实验结果显示，对照组细胞数为（195 200±5 100）个，IWR-1-endo联合照射组细胞数为（94 234±3 394）个，两组比较，差异有统计学意义（t=16.790，P=0.000），IWR-1-endo联合照射组U87细胞增殖能力减弱（见图3A）。照射组、对照组及IWR-1-endo联合照射组细胞增殖个数比较，差异有统计学意义（F=673.700，P=0.000）。进一步组间两两比较，经LSD-t检验，对照组与照射组细胞数比较，差异有统计学意义（t=32.260，P=0.000），对照组与IWR-1-endo联合照射组细胞数比较，差异有统计学意义（t=30.080，P=0.000），照射组与IWR-1-endo联合照射组细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。照射组和IWR-1-endo联合照射组比对照组U87细胞增殖个数少。而照射组和IWR-1-endo联合照射组的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见图 3B）。

图1　人脑胶质瘤U87细胞的鉴定

图2　对照组和照射组细胞中 β-catenin的表达

平板克隆实验显示，IWR-1-endo联合照射组的细胞克隆形成率为（0.360±0.050）%，对照组细胞克隆形成率为（0.770±0.110）%，经t检验，差异有统计学意义（t=5.513，P=0.005），IWR-1-endo联合照射组细胞克隆形成率降低（见图3C）。照射组、对照组及IWR-1-endo联合照射组细胞克隆形成率比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=46.810，P=0.0002）。进一步两两比较，经LSD-t检验，对照组与照射组细胞克隆形成率比较，差异有统计学意义（t=9.589，P=0.002），对照组与 IWR-1-endo联合照射组细胞克隆形成率比较，差异有统计学意义（t=5.915，P=0.010），照射组与IWR-1-endo联合照射组细胞克隆形成率比较，差异有统计学意义（t=3.674，P=0.035）。照射组和IWR-1-endo联合照射组比对照组的U87细胞克隆形成率低，而IWR-1-endo联合照射组的细胞克隆形成率比照射组高（见图3D）。

电镜结果显示，对照组线粒体成椭圆形，双层膜及线粒体嵴较清晰（见图4A）；高剂量X射线照射后，U87细胞线粒体肿胀，形状接近圆形，外膜较完整，但中央为细粒状物质或大空泡（见图4B）；但IWR-1-endo联合照射组在经过X射线照射后，部分线粒体形状较正常，只有少量肿胀呈圆形，中央为细粒状物质或大空泡（见图4C）。经X射线照射的细胞内线粒体肿胀严重，嵴几乎完全消失（见图4B）；而经X射线照射的IWR-1-endo联合照射组中，细胞内线粒体形状较为完好（见图4C）。提示IWR-1-endo可能通过抑制β-catenin的表达，起到保护细胞线粒体的作用。

图3　各组细胞增殖、克隆形成率比较（±s）

图4　3组透射电镜图

3　讨论

射线对细胞的直接影响来源于辐射能量干扰细胞的氧化防御体统，细胞中活性氧增多，最终导致细胞DNA损伤[7]。然而，细胞会通过改变基因表达、改变细胞因子表达量等方式对辐射产生抗性[8-11]。在本研究中，受到高剂量X射线照射的U87细胞中β-catenin蛋白表达量降低，提示细胞中β-catenin的表达变化可能与辐射有一定关系。β-catenin是具有多种功能的蛋白，在细胞黏附和基因转录中发挥重要作用，并且在β-catenin在有丝分裂过程中参与促进中心体分离[12]。细胞中β-catenin的累积受有糖原合成酶激酶3β、Axin蛋白参与的多种蛋白组成的破坏复合体的影响，被破坏复合体磷酸化β-catenin进一步被蛋白酶体水解[13]。因此稳定破坏复合体或诱导其组成蛋白，可以促进β-catenin的磷酸化和降解，从而减少细胞中β-catenin的累积。为了验证此推论，笔者选取IWR-1-endo来抑制细胞中β-catenin。IWR-1-endo是一种Axin蛋白激活剂，可以降低细胞中β-catenin的表达量。随着β-catenin的降低，受辐射的细胞表现出辐射抵抗的现象，如细胞增殖和克隆形成率增高等。CCK-8细胞增殖检测可以灵敏、快速检测活细胞数量变化；而细胞平板克隆实验可以反应细胞贴壁后的存活率及增殖活力，反应了细胞群体依赖性和增殖2个重要性状，用于评估辐射对细胞的亚致死性损伤情况。结果显示，在未经辐射照射前，IWR-1-endo可以抑制细胞增殖和克隆形成率，说明此条件下β-catenin表达降低，对U87增殖和存活能力起到抑制作用。但经IWR-1-endo处理的细胞在接受辐射后，增殖细胞数和平板克隆形成率呈增加的趋势。以上结果显示，β-catenin表达降低对细胞抵抗辐射伤害可能有保护作用。透射电镜结果发现，β-catenin表达降低的细胞在接受辐射后，线粒体结构较对照组相对完整，线粒体形态较正常。提示β-catenin表达降低可能通过保护线粒体来抵抗辐射引起的细胞凋亡，从而起到保护作用。以往研究发现，电离辐射引起内源性自由基增多，其作用位点主要为线粒体膜、DNA及蛋白质，对线粒体转膜功能、mtDNA的断裂和碱基突变、ATP合成等都有直接影响，因此线粒体是电离辐射诱导的凋亡的主要靶点[14-15]。线粒体形态与细胞凋亡有密切联系，线粒体从管状向点状表型的转换是细胞凋亡的表现，线粒体嵴重塑和开放与细胞色素C介导的细胞凋亡有关[16]。综上所述，β-catenin表达量的降低能维持辐射后细胞中线粒体形态，这个作用可能与细胞对辐射损伤的抵抗有关。