乳腺癌组织中Cx43表达水平及其临床意义的Meta分析

周霖，张钰萍，何丽，尤倩，彭飞，吴意

（1.湖南师范大学附属第一医院，湖南 长沙 410005；2.湖南省郴州市中医医院 检验科，湖南 郴州 423000；3.湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013）

近年来，国内乳腺癌（breast cancer,BC）发病率呈逐年上升趋势，居于女性恶性肿瘤之首，发病率最高的是经济发达的沿海城市[1-2]。近几年有学者研究称细胞缝隙连接蛋白43（connexin 43,Cx43）在人类多种肿瘤的产生、生长及预后中发挥不可缺少的作用[4]。国内外都有相关研究报道Cx43表达和乳腺癌的临床病理特征存在着某种关联，但得到的结论却不全然相同[5-8]。本研究通过Meta分析为乳腺癌的防治奠定循证医学证据，从而探索开辟出一条新的道路。

1　资料与方法

1.1　文献检索策略

检 索 PubMed、Embase、Web of Science、 循 证医学数据库、中国知网及万方数据库公开发表的文章，截止时间为2017年4月，加以文献追溯、手工检索等方法查找Cx43表达与乳腺癌相关的文献，检索语种限定为中文和英文，中文检索关键词为乳腺癌和缝隙连接蛋白43，英文检索关键词为breast cancer、BC、breast carcinoma、mammary cancer、connexin43及Cx43。纳入标准：①研究对象为人类的对照研究；②在国内外公开发表，提供原始数据的Cx43表达与乳腺癌病理特征关系相关的对照研究分析；③所有患者有完整的临床病理资料；④Cx43检测方法为免疫组织化学染色法，且评分标准一致等；⑤各参考文献研究方法及研究问题相似。排除标准：①没有提供原始数据的综述；②未设立对照组；③Cx43检测方法为非免疫组织化学染色法及阳性判断标准不一致者；④反复发表、资料相近及质量较粗糙等没法使用的文件资料；⑤未提及临床病理因素，也无预后结果，如整体生存率、5年存活率等。

1.2　质量评价

参照纽卡斯尔渥太华量表（newcastle-ottawa scale,NOS）设立质量评价体系，对归入研究进行质量衡量。衡量内容主要包括以下3个基点：病例选择性、基线可比性及暴露原因，共8个条目，每个条目给分点为1～2分，每篇研究评价得分为0～9分。如果总分≥6分，则认为研究文献内容较好，若总分＜6分，则该文献不归入研究。见表1。

1.3　文献筛选及数据提取

根据检索策略进行文献检索，先通过阅读标题和摘要进行文献初筛，然后阅读全文，依照纳入与排除标准进行筛选。最后有14篇文献被纳入，其中一共有1 039例研究样本量，应抽取的关键点主要包含：编号、文题、第一作者姓名、出版时间、所在地、检测样本总数、研究方法、乳腺癌及其TNM分期、组织学分级、淋巴结转移及Cx43表达相关预后指标（如5年存活率和整体生存率等）。纳入文献免疫组织化学阳性依据：细胞染色≥10%的标本为阳性者。

1.4　文献筛选结果

应用上述文献检索方法，共计检索到90篇文献。通过阅读标题及摘要排除掉50篇（包括动物实验文献、非乳腺癌研究、非生物分子类研究、综述文献及重复性文献等），再对剩下的文献通过全文分析，删除掉12篇文献，对二次纳入的28篇文献进行仔细阅读，排除掉Cx43分子研究法和免疫组织化学法对阳性结果评分标准不一致的文献14篇，最终纳入研究的文献为14篇，其中＞10篇文献以亚洲人种为主[13-15，19]。见表2。

1.5　纳入研究的特征及质量评价结果

最终纳入的14篇文文献均以免疫组织化学法作为Cx43的研究方法，此外，每篇纳入的文献的NOS评分≥7分，说明纳入的文献质量均较高。见表3。

表1　NOS质量评价表

表2　纳入文献特征

1.6　统计学方法

数据分析采用Review Manager 5.3统计软件，计算出相关评价指标优势比（odds ratio,OR），95%置信区间（confidential interval,CI）成为效应量显示成果。临床异质性：按照纳入与排除标准及文献质量评分量表筛除掉低质量文献，减少临床异质性。统计学异质性：首先对纳入的原始文献进行Q检验，I²检验来评估纳入研究间的异质性，根据异质性检验结果（P值，I²值）选择固定效应模型或随机效应模型求得效应合并值。若P＞0.05，I²＜50%，能够作为多个单独研究间不存在异质性，则选用固定效应模型来分析。若P＜0.05，I²＞50%，阐明了多个研究之间拥有异质性，需从研究对象特点，预防手段的变化情况等角度分析异质性存在的缘由，必要时需采用敏感性分析或亚组分析等异质性处理方案诠释，经处理后如果没有异质性，再拟用固定效应模型。若是未挖掘出异质性源头，就拟用随机效应模型。如果通过分析发现异质性来源，需要对纳入排除标准及文献质量再次做出评估，并进行敏感性分析，随意剔除单个文献，重新进行Meta分析，观测合并指标变化与否来检验分析结果的平稳性，若异质性显著存在，则放弃Meta分析，若解决了异质性来源，则拟用相对应的模型进行分析。最终分析结果通过绘制森林图来评价效应量，通过漏斗图检测发表偏倚是否存在。

表3　纳入文献质量评价结果

2　结果

2.1　乳腺癌与正常乳腺组织Cx43阳性表达率的比较

9个原始研究进行了Cx43在乳腺癌组织与正常乳腺组织阳性表达率的比较，其中乳腺癌组有632例，正常乳腺组织组有240例[8-9，13-19]。通过异质性检验，提示两研究结果间无异质性故采用固定效应模0.10）]。乳腺癌 Cx43阳性表达率为 40.51%（256/632），正常乳腺组织阳性表达率为92.50%（222/240），差异有统计学意义（χ2=10.910，P=0.000），乳腺癌组织中Cx43阳性表达率低于正常乳腺组织。Cx43阳性表达率在乳腺癌组织和乳腺正常组织的比较研究中存在一定的发表偏倚。见图1、2。

图1　乳腺癌与正常乳腺组织Cx43阳性表达率比较森林图

图2　乳腺癌与乳腺正常组织Cx43阳性表达比较的漏斗图

2.2　乳腺癌与乳腺增生组织Cx43阳性表达率比较

4篇文献归入探讨Cx43在乳腺癌与乳腺增生组织阳性表达率的研究对比，乳腺癌组被归入244例，乳腺组织增生组被归入167例[11，14-15，19]。两组通过进行异质性检验，差异有统计学意义故选用随机效应模型乳腺癌中Cx43阳性表达率为42.62%（104/244），乳腺增生组织Cx43阳性表达率为87.43%（146/167），差异有统计学意义（χ2=2.680，P=0.007），乳腺癌组织Cx43阳性表达率低于乳腺增生组织。漏斗图基本呈不对称分布，展示出Cx43阳性表达率在乳腺癌和乳腺增生组织的比较研究中存在发表偏倚。见图3、4。

2.3　乳腺癌组织TNM Ⅲ、Ⅳ期与TNMⅠ、Ⅱ期的Cx43阳性表达率比较

4篇研究纳入Cx43在乳腺癌组织TNMⅢ、Ⅳ期与TNMⅠ、Ⅱ期表达阳性表达率的比较，其中乳腺癌组织TNMⅢ、Ⅳ期91例，乳腺癌组织TNMⅠ、Ⅱ期组有 217 例[11，15，17，19]。通过进行异质性检验，差异无统计学意义故选用固定效应模型乳腺癌TNMⅢ、Ⅳ期Cx43阳性表达率为25.27%（23/91），TNMⅠ、Ⅱ期Cx43阳性表达率为47.93%（104/217），差异有统计学意义（χ2=4.080，P=0.000），Cx43在乳腺癌组织TNMⅢ、Ⅳ期中的阳性表达率低于乳腺癌组织TNMⅠ、Ⅱ期。漏斗图基本呈对称分布，展示出Cx43阳性表达率在乳腺癌不同TNM分期的比较研究中存在较小的发表偏倚。见图5、6。

图3　乳腺癌与乳腺增生组织Cx43阳性表达率比较森林图

图4　乳腺癌与乳腺增生组织Cx43阳性表达比较的漏斗图

图5　乳腺癌组织TNMⅢ、Ⅳ期与TNMⅠ、Ⅱ期Cx43阳性表达率比较森林图

图6　乳腺癌TNMⅢ、Ⅳ期与TNMⅠ、Ⅱ期Cx43阳性表达率比较的漏斗图

2.4　乳腺癌组织学分级Ⅲ级与Ⅰ、Ⅱ级的Cx43阳性表达率比较

乳腺癌组织学分级主要从腺管多少、细胞核异质性及核分裂情况3个方面评价。一直以来，乳腺癌分化程度和其预后情况备受医学界关注。乳腺癌恶性程度与组织学分级成正比，与分化程度呈反比。总共有7篇文献被归入Cx43在乳腺癌组织学分级Ⅲ级与Ⅰ、Ⅱ级中阳性表达率的对比研究，其中乳腺癌组织学分级Ⅲ级标本有267例，乳腺癌组织学分级Ⅰ、Ⅱ级标本有356例[11，15，17-19，20，24]。通过进行异质性检验，差异无统计学意义故选用随机效应模型Cx43 在乳腺癌组织学分级Ⅲ级中的阳性表达率为35.58%（95/267），在乳腺癌组织学分级Ⅰ、Ⅱ级中的阳性表达率为49.10%（174/356），两者比较，差异有统计学意义（χ2=2.750，P=0.006），Cx43在乳腺癌组织学分级Ⅲ级中的阳性表达率低于组织学分级Ⅰ、Ⅱ级。漏斗图基本呈不对称分布，展示出Cx43阳性表达率在乳腺癌组不同组织学分级的比较研究中存在一定的发表偏倚。见图7、8。

图7　乳腺癌组织学分级Ⅲ级与Ⅰ、Ⅱ级Cx43阳性表达率比较森林图

图8　乳腺癌组织学Ⅲ级与Ⅰ、Ⅱ级Cx43阳性表达率比较的漏斗图

2.5　乳腺癌组织中有无淋巴结转移的Cx43阳性表达率比较

8篇文献纳入研究比较Cx43在乳腺癌组织中有无淋巴结转移的阳性表达率，其中乳腺癌组织有淋巴结转移组有351例，乳腺癌组织无淋巴结转移组有311例[10-11，14-15，17，19-20，24]。通过进行异质性检验，差异有统计学意义故选用随机效应模型Cx43在乳腺癌组织有淋巴结转移中阳性表达率为44.73%（157/351），在乳腺癌组织无淋巴结转移中阳性表达率为46.30%（144/311），差异无统计学意义（P＞0.05），Cx43在乳腺癌组织有无淋巴结转移中的阳性表达率没有意义。漏斗图呈不对称分布，展示出Cx43阳性表达率在乳腺癌组织中有没有淋巴结转移的比较研究中存在某个范围上的发表偏倚，或许会造成对局部试验成果的准确性及稳定性产生某种程度上的影响。见图9、10。

图9　乳腺癌组织中有无淋巴结转移Cx43阳性表达率比较森林图

图10　乳腺癌中有无淋巴结转移的Cx43阳性表达率比较的漏斗图

3　讨论

肿瘤的生长由多因素多环节参与，是一个漫长的的变化过程，由癌基因和抑癌基因调控着的细胞增殖与凋亡相互作用的成果，它们之间的动态平衡保持着人体内环境的稳态和人体构造组分的正常生长、发育。一般来讲，在正常情况下，乳腺组织中的细胞生长增殖与细胞凋亡（即细胞程序化死亡）在有条不紊、相应均衡地发展，进而维持乳腺组织正常孕育、发育及分化，保持腺体正常的形态和功能[25]。当在外因与内因相互作用下机体失衡便会引起肿瘤的发生。就现在而言，女性恶性肿瘤的头号杀手变成了乳腺癌，是胁迫女性生命健康的重要疾病之一，到现在为止，乳腺癌发病率仍呈现出增高的走势，大概占全部癌症的15%[26]。

每一个机体和组织都存在着不一样的连接蛋白亚型，可以演变成具备差别功能的连接子。连接子的重要组分是间隙连接蛋白，它的六聚体能够构成1个连接子[27]。2个连接子演化成1个间隙链接（细胞间通道），通过介入细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传导的电偶联，能够让细胞间发生物质、能量及信息互换，并管控着细胞的新陈代谢、细胞的增殖、分化和内环境的安稳秩序等生理历程[28]。肿瘤表型和联接通道蛋白表达减少及细胞间隙联通受损有很大关联[29]。有研究者提出，Cx43在肝癌、肺癌及前列腺癌中均减少，在人类乳腺上皮细胞及乳腺癌组织中也都有产生，并在上皮细胞分化，癌变历程中发挥关键作用[30]。Cx43可通过开启子甲基化、C末端氨酸残基磷酸化等渠道产生下调来抑制乳腺肿瘤细胞的增殖、弱化肿瘤的侵袭力，且有不少研究表明Cx43表达与一些预后因子如肿块大小、淋巴结转移及组织学分级等临床病理特征相关[23，30]。但所得的结论都颇有争议，该分子的发现及研究价值为越来越多的研究者所探讨，有望能够为乳腺癌的治疗及预后提供可靠指标，为乳腺癌患者带来福音。但是目前，国内外仍没有相关文献研究报道Cx43能否成为乳腺癌预后的独立因素来评价乳腺癌患者的病情。因此本文决定收集整理大批量文献资料，用于数据整合汇总，采用Meta分析定量统计，为Cx43分子对乳腺癌发生发展及预后有无重大的研讨意义提供循证医学根据。

从现有的许多研究可见，乳腺癌组织中Cx43表达程度可能与Cx43检测方法有关，但大量数据研究结果都显示Cx43在乳腺癌组织中低表达。在乳腺癌产生生长的所有过程中都串联着Cx43低表达或不表达，却在正常乳腺组织和乳腺增生组织中高表达，与本文Meta分析结果相符[31]。在乳腺癌组织中，Cx43表达减弱或缺失，机体对细胞的监管和管控能力就会削弱，使得细胞间通信交流异常，导致肿瘤细胞过度克隆增殖。Cx43产生减少只是表达梯度的降低，并不是遗传因子的畸变或缺失，在正常乳腺组织和乳腺良性增生组织中Cx43高表达，有利于细胞间通信链接的拼装，巩固细胞之间的信号交换，使得细胞间的生长彼此被抑止，从而维持细胞的正常形态和功能[31]。此外，有很多研究涉及到Cx43表达与淋巴结转移情况、远端转移情况、肿块大小、肿瘤分期、组织学分级及病理分期等很多预后因子的干系，希望通过这些探索研究确定Cx43能否成为乳腺癌有意义的预后因子。张光谋、张立英及高一菁等在研究中均表明乳腺癌组织中Cx43表达与TNM分期密切相关，TNMⅢ、Ⅳ期表达阳性率低于TNMⅠ、Ⅱ期[11，14-15，17]。TNM一般来讲肿瘤分期与肿瘤进展情况、恶劣程度成正相关，初期肿瘤比后期肿瘤预后效果相对要好。本文Meta分析结果显示，Cx43在乳腺癌不同TNM分期中表达有差异，说明Cx43表达下调表现在乳腺细胞癌变的全过程，Cx43表达水平越低可能提示乳腺肿瘤恶性程度越高。在具有相同临床分期的乳腺癌中，组织学分级越高，患者的5年存活率越低，Cx43在乳腺癌不同组织学分级中的表达可能衍变为1个险要成分，但各项研究结果却不尽相同。ZHOU、张光谋及高一菁等[11，14-15，18，20]研究发现 Cx43表达与组织学分级密切相关，随着乳腺癌组织学分级增高而不断减弱。而FU等[24]认为Cx43表达在不同组织学分级没有差别。本文Meta分析研究结果显示，Cx43在乳腺癌组织中组织学分级Ⅲ级表达阳性表达率低于组织学分级Ⅰ、Ⅱ级，提示Cx43在乳腺癌的发生、发展及细胞分化中发挥着重要的作用，肿瘤分化能力越差提示恶性程度越高，Cx43表达就越低。淋巴结转移是指脱落肿瘤细胞到达汇流区淋巴结，并以此围绕成长出相同癌细胞的表象形式，它是最为常见的肿瘤转移方式。乳腺癌淋巴结转移与许多种因素息息相关，Cx43表达下调有没有提示乳腺癌有淋巴结转移，研究所得结论尚且存在着差异，KANCZUGAKODA等[10]以为Cx43表达与乳腺癌有无淋巴结转移密切相关，甚至在乳腺癌有淋巴结转移组织中高表达，张光谋、张立英及高一菁等[11，14-15，17，20]则以为 Cx43 在乳腺癌有淋巴结转移组织中低表达。而FU、涂永久等研究却认为Cx43表达与乳腺癌有无淋巴结转移无差异。本文Meta分析结果显示，Cx43在乳腺癌组织中有没有淋巴结转移情况下阳性表达率没有关系。出现这种结果差异的原因可能是Cx43检测方法虽为免疫组织化学法，但是所使用的抗体试剂厂家不同，如KANCZUGA-KODA使用的是多克隆山羊Cx43抗体（1∶200稀释；上海圣克鲁斯生物技术有限公司），高一菁利用的是兔抗人Cx43多克隆抗体（ZA-0444，即用型，北京中杉金桥生物技术公司）。张光谋研究使用的是SP免疫组织化学法（生物素检测系统），高一菁用的是Elivision免疫组织化学法（非生物素检测系统），均对结果产生一定的影响[10-11，14-15]。

本研究的不足之处：纳入研究的文献总体来说数量较少，数据收集存在一定的局限性，可能会影响Meta分析结果的可信度。本文缺少灰色文献，在分析过程中不可避免的存在各种偏倚，最常见的就是发表偏倚和语言偏倚。一般地，由于研究结果的目标性太强导致不可能包含全部相干研究，那么，那些预防操作和结果显著悬殊的研究（即阳性成绩）就很容易被发布，而那些阴性结果的研究通常会被忽视。当存在发表偏倚时，需要用漏斗图检测识别，当文献样本量少时，数据分散分布在漏斗图底部，研究精确度低。所以，一般纳入研究文献要求≥10篇，才有研究意义。其次，还存在语言偏倚，本文所检索文献没有除去英文和中文以外的文献，这也会对研究文献的综合性和科学性产生影响。

当两组研究间有着异质性时，可以采用用随机效应模型处理数据，但当异质性＞75%时，一般情况下不建议进行文献合并，需要先进行亚组分析或者回归剖析解决异质性。再者，Meta分析本身有一些方法学缺陷都会对结果产生一定的影响，基于上述几点原因，本文Meta分析结果只能作为估测结论，尚且有待用大规模的、前瞻性的研究辅以证实。故有待于设计更严谨科学的高质量研究方案，来进一步落实Cx43分子表达与乳腺癌的关联，用更严明的依据来阐明乳腺癌防治的分子机制。

综上所述，可见Cx43低表达可以增强乳腺肿瘤的增殖、侵袭能力，降低组织分化能力说明Cx43在乳腺癌发生发展过程中扮演着重要角色，可以作为乳腺癌治疗及预后的参考指标之一，为临床上乳腺癌治疗及预后评估提供更多依据，并具有成为乳腺癌药物靶点治疗的潜能。