Shewanella oneidensis MR-1对Cr(VI)的还原及其影响因素

杜艳影,刘小红,2,李 劲,李磊明,司友斌* (.农田生态保育与污染防控安徽省重点实验室,安徽农业大学资源与环境学院,安徽 合肥 230036；2.中国科学院南京土壤研究所土壤环境与污染修复重点实验室,江苏 南京 20008)

环境中Cr主要以Cr(III)和Cr(VI)形式存在,前者低毒[1],且能在中性条件下与氢氧化物生成沉淀而得以去除;而Cr(VI)具有剧毒且易溶于水,容易在水体中迁移转化和生物富集,浓度较高时能造成人体皮肤溃烂、眼睛刺痛和消化道粘膜损伤等,低浓度时也会有致癌、致畸、致突变效应,对人类健康和环境造成严重的影响.Cr(VI)的处理通常采用还原中和、离子交换、铬酸钡沉淀等方法[2].近年来,也有报道利用生物材料吸附法去除水中 Cr(VI)[3].但这些方法都有污染大、难回收、易造成二次污染等特点.目前研究发现许多微生物对 Cr(VI)具有很强的抗性,并能在好氧或厌氧状态下将 Cr(VI)转化为毒性较低的 Cr(III)[4].由于细菌在生长过程中不断进行繁殖,因此在代谢活动中可不断将 Cr(VI)还原为 Cr(III),而不会出现反应饱和现象.另外,生物法设备简单,投资少[5],在 Cr(VI)去除方面值得推广.微生物还原 Cr(VI)的机制目前也是研究的热点.

Shewanella oneidensis MR-1属于革兰氏阴性兼性厌氧细菌,适宜生长温度30℃,在培养皿中经48h培养形成圆形、橘黄色、无光泽、表面光滑、边缘规则的菌落[6].S. oneidensis MR-1属于典型铁还原菌,使重金属还原,从而起到解毒作用[7].而微生物通过自身的生理活动直接将 Cr(VI)还原为 Cr(III),被普遍认为是酶促反应过程,即为生物体内某些还原酶的还原作用,这些酶通称为 Cr(VI)还原酶[8].研究发现 S.oneidensis MR-1可在20min内将100mmol/L的Cr(VI)还原为 Cr(III),而且铬酸盐的增加对菌体生长无影响[9].此外,发现腐败希瓦氏菌 S. putrefaciens MR-1[10]、认为苍白杆菌Ochrobactrum sp.[11]都可将Cr(VI)还原为 Cr(III).对于其还原机理,研究发现 S.putrefaciens MR-1对铬还原后的沉淀在细胞内和细胞外都存在,但是未确定沉淀的化学形态[12].S.oneidensis MR-1在以甲烷为碳源条件下对水铁矿的还原率很低[13].关于微生物对 Cr(VI)还原的机理研究一直都颇具争议.本文主要研究S. oneidensis MR-1对 Cr(VI)还原作用及其影响因素,并且采用 SEMEDS、XPS等方法进行表征.

1 材料与方法

1.1 实验材料

重铬酸钾(K2Cr2O7,纯度≥99.8%);铬储备液(500mg/L)于4℃冰箱保存;铁储备液(100mg/L)于4℃冰箱保存;二苯碳酰二肼、丙酮、硫酸、硫酸亚铁铵、盐酸羟胺、邻菲啰啉、冰醋酸、三氯化铁、无水乙醇、盐酸均为分析纯.

菌种来源:S. oneidensis MR-1由西北农林科技大学土壤微生物实验室提供.

菌悬液的配制主要采用 LB培养基,后期试验所用培养基为S. oneidensis MR-1专性培养基.

LB富集培养基(g/L):牛肉膏 5.0,蛋白胨 10.0,NaCl 5.0,pH值调至7.0左右;固体培养基再按1.5%～2.0%的比例加入琼脂粉,121℃灭菌30min[7].

S.oneidensis MR-1专性培养基(g/L):KH2PO4·7H2O 3.0、Na2HPO4·7H2O 12.8、NH4Cl 1.0、NaAc 2.0、酵母抽提物2.0[7].

菌悬液的制备:在无菌条件下,将保存的 S.oneidensis MR-1接种到固体LB培养基中,恒温30℃培养,经过24h培养生长,将S. oneidensis MR-1转移到已灭菌的液体培养基中继续恒温培养.在液体 LB培养基中,30℃恒温振荡,摇菌转速180r/min,经过24h培养进入对数生长期.

人工合成 Fe(OH)3的制备方法:称取 38.07g FeCl3·6H2O 于 1L大烧杯中,加入去离子水 1000mL,搅拌使其溶解,滴加1mol/L NaOH溶液,控制pH值在7.0～7.6之间,可得红褐色悬浮状Fe(OH)3即为人工合成的 Fe(OH)3原液.人工合成的 Fe(OH)3具有比表面积大和活性高的特点.

1.2 实验方法

将S. oneidensis MR-1菌悬液无菌操作接种至含有液体S. oneidensis MR-1专性培养基的血清瓶中,并添加 Cr(VI)溶液,充氮气除氧,加盖密封,置于 30℃摇床中 150r/min 振荡培养,定期采集样品,测定培养液及细胞中 Cr(VI)浓度变化.同时设置不添加 S.oneidensis MR-1菌悬液作为对照,每种处理3次重复.

菌株的厌氧培养:在超净厌氧工作台上,高纯 N2通过一个装有细菌过滤器的塑胶管充入装有培养液的棕色瓶中.充气15min后,快速拧紧瓶盖密封后置于30℃恒温培养箱中静置培养.

影响因素的设置:分别调节液体培养基的 Cr(VI)浓度、接菌量,pH值,Fe(OH)3投加量.调节Cr(VI)浓度为0,5,10,20,30mg/L;接菌量的设置是将0.1,0.2,0.4mL S.oneidensis MR-1菌悬液接种至20mg/L的Cr(VI)液体培养基中,溶液总体积为 20mL;控制 pH 值为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,Fe(OH)3浓度分别设置投加0,0.5,1,1.5mmol/L Fe(III)(以 Fe(OH)3形式).

样品提取:样品摇匀后取3组5mL悬浊液:一组稀释5倍后用于测定OD值,并且转换成细胞数[14];一组放入10mL离心管以4000r/min离心10min后,测定六价铬的含量;一组用注射器将悬浊液吸出,用孔径为0.45µm 滤膜过滤,收集滤液,放入 4℃冰箱保存,用于测定总铬.

六价铬测定:本实验采用二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr(VI)含量.

1.3 扫描电镜能谱分析(SEM-EDS)

取培养好的S.oneidensis MR-1菌液, 1500r/min离心8min,弃去上清液.分别加入0.1moL/L磷酸盐缓冲液(pH7.2),1500r/min离心8min,弃去上清液,重复两次.依次进行固定、漂洗、脱水、干燥后,取适量菌体粉末置于扫描电镜(日立S-4800型)样品台上,镀膜处理后对样品进行观察,并用扫描能谱(Model H-7650,Hitachi, Japan)对菌体进行成分分析[15].

1.4 X射线光电子能谱分析(XPS)

高性能 X射线光电子能谱(XPS)[16],仪器型号为Thermo ESCALAB 250,X射线激发源为单色Al Ka(hv =1486.6eV),功率 150W,X 射线束斑 500 µm,能量分析器固定透过能为30eV.

1.5 数据处理与分析

Cr(VI)还原率的计算方法:

式中:ω为 Cr(VI)的还原率,%;C0为初始 Cr(VI)的浓度,mg/L;Ct为T时刻Cr(VI)的浓度,mg/L.

相关数据分析用Excel和Origin 8.5软件处理.

2 结果与讨论

2.1 S. oneidensis MR-1的生长曲线及其对 Cr(VI)的还原

图1 不同Cr(VI)浓度下S. oneidensis MR-1的生长曲线Fig.1 Growth curves of S. oneidensis MR-1at different concentrations of Cr(VI)

图2 Cr(VI)初始浓度对S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)的影响Fig.2 Effect of initial Cr(VI) concentration on Cr(VI) reduction by S. oneidensis MR-1

不同 Cr(VI)浓度会对微生物的生长及活性产生不同的影响,并表现为不同的Cr(VI)还原率.由图1可见,在 30℃、pH 7.0条件下,未添加 Cr(VI)时,S.oneidensis MR-1生长较快,连续培养3d后,菌体浓度每 mL高达 1.2×108个.当添加不同浓度 Cr(VI)后,S.oneidensis MR-1的生长受到一定程度的抑制,其菌体浓度增长呈现不同程度的降低.随着 Cr(VI)浓度的增大,Cr(VI)对菌株的毒性越强,当Cr(VI)浓度为30mg/L时,在培养 3d后菌体浓度每 mL仅为 2.01×107个,表明Cr(VI)浓度越高,对S. oneidensis MR-1生长的抑制越强.从图2可知,Cr(VI)还原率随着Cr(VI)初始浓度增大而显著减小.Cr(VI)初始浓度为 5mg/L的处理组,Cr(VI)去除率在1d内便达到了95%,当Cr(VI)初始浓度为20mg/L,Cr(VI)还原率在18h内只达到25%,7d才达到88%.研究结果表明,初始Cr(VI)浓度对Cr(VI)还原率影响较大,Cr(VI)初始浓度在 20mg/L及以下时,Cr(VI)还原率随反应时间增加较快,且最终基本可达到 100%;当 Cr(VI)初始浓度在 30mg/L,Cr(VI)还原率增加缓慢.由图2可知,在相同反应时间内,Cr(VI)还原量随 Cr(VI)初始浓度增大而呈减少趋势.随着反应进行,单位时间内Cr(VI)的去除量逐渐减少.这是因为,随着 Cr(VI)初始浓度的增加,细胞受较高浓度 Cr(VI)毒性影响而降低了活性并减弱了还原能力,最终抑制了Cr(VI)的还原[9].

2.2 S. oneidensis MR-1接种量对Cr(VI)还原的影响

在其他条件不变的情况下,改变微生物接种量,研究S. oneidensis MR-1接种量对Cr(VI)还原的影响.从图3中可以看出,随着接种量的增加,Cr(VI)还原率也逐渐增大.当微生物接种量为 0.5×107、1×107、2×107CFU/mL时,Cr(VI)还原率在第 1d分别达到15%、25%和40%,在第7d分别达到80%、88%和100%;当接种量为2%时,20mg/L Cr(VI)还原率在第7d可以达到 100%.微生物在 Cr(VI)还原过程中具有十分重要的作用,增加接种量有利于Cr(VI)的生物还原.

图3 接种量对S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)的影响Fig.3 Effect of microbial inoculation density on Cr(VI)reduction by S. oneidensis MR-1

2.3 初始pH值对S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)的影响

初始 pH 值分别为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,Cr(VI)浓度为20mg/L,在S. oneidensis MR-1作用下,Cr(VI)还原曲线如图4所示.从图4可以看出,S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)的最适pH值为7.0,此时Cr(VI)还原率在第7d就达到了88%,pH值为5.0时Cr(VI)还原率最小,7d时只有 48%.而偏酸偏碱都会影响微生物对Cr(VI)的还原.pH为5.0时Cr(VI)还原率最小,pH 9.0时的Cr(VI)还原率高于pH 5.0.在弱碱性环境中多数菌体生长较好,而弱酸性环境中很多细菌也能生长,但细菌在弱碱性环境中的生长状况好于弱酸性环境[17].在 Cr(VI)的微生物还原过程中,酶起到主导作用,合适的pH值环境有利于酶活性的提高.

图4 初始pH值对S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)的影响Fig.4 Effect of initial pH on Cr(VI) reduction by S. oneidensis MR-1

2.4 Fe(III)浓度对Cr(VI)还原的影响

微生物可以通过代谢产物间接还原 Cr(VI),例如Fe(III)还原菌可以将Fe(III)还原为Fe(II),再利用Fe(II)与 Cr(VI)反应,将 Cr(VI)转化为低毒性和低迁移性的Cr(III),从而达到去除 Cr(VI)的目的[18].为考察 Fe(III)投加量对 Fe(III)-微生物体系还原 Cr(VI)的影响,分别设置投加 0,0.5,1,1.5mmol/L Fe(III)(以 Fe(OH)3形式)的处理组,进行S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)试验,结果如图5.

从图中可以看出,投加了 Fe(III)的实验组均取得了较好的Cr(VI)还原效果,Cr(VI)还原率在7d内均达到 100%.而随着 Fe(Ⅲ)投加量的增加,Cr(VI)还原率虽仍有所增大,但增幅有限.由此可知,超过一定的浓度范围,Fe(III)投加量对 Cr(VI)还原的影响不明显.试验中,没有投加Fe(III)的处理,在第7d时Cr(VI)的还原率只达到了88%.

Fe(III)-微生物体系中 Cr(VI)的还原,微生物可通过直接还原和间接还原两种方式作用于Cr(VI)[19].未投加 Fe(III)时,微生物通过酶促反应直接还原Cr(VI),还原速率较慢.投加 Fe(III)后,微生物可以较快地将 Fe(III)还原,同时生成的 Fe(II)可以与 Cr(VI)快速反应,将Cr(VI)还原为Cr(III),而Fe(II)自身被氧化为 Fe(III),可以重新参与氧化还原反应.这在一定程度上,也可以解释 Fe(III)投加量增加时,Cr(VI)还原率增幅不大,是由于 Fe(Ⅲ)可以重复循环使用,即使投加较少量的 Fe(III)也足以较快地完成全部Cr(VI)的还原.

图5 不同浓度Fe(OH)3对S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)的影响Fig.5 Effects of different Fe(OH)3 concentration on Cr(VI)reduction by S. oneidensis MR-1

2.5 S. oneidensis MR-1吸附Cr(VI)的扫描电镜及能谱分析

图6 S. oneidensis MR-1吸附Cr(VI)的扫面电镜能谱图Fig.6 The SEM and EDS spectrum for S. oneidensis MR-1exposure to Cr(VI)

通过扫描电镜(SEM)-能谱(EDS)实验,对菌体表面形态和 Cr(VI)吸附进行观察.王娟等[20]的实验结果显示,S. oneidensis MR-1在纯培养48h后菌体呈圆形、橘黄色、无光泽、表面光滑、边缘规则.而本实验扫描电镜能谱结果显示,添加Cr (VI)处理后的实验组,菌体形态有了一定的变化,并在菌体表面有 Cr的吸收峰出现.这说明菌体在对 Cr(VI)进行还原的过程中首先对Cr进行吸附作用.

2.6 S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)的X射线光电子能谱分析

活体微生物可以直接还原Cr(VI),将Cr(VI)还原为Cr(III).为分析微生物体系Cr(VI)还原的产物,以及菌体表面及内部Cr的形态特征,本研究采用高性能X射线光电子能谱仪对S. oneidensis MR-1还原Cr的形态进行表征[21-22].

图7为微生物体系Cr(VI)还原后,菌体中Cr形态的XPS全谱图.图中明显出现C、N、O、Cr元素的俄歇谱线,以及Cr2p、C1s、O1S和N1s轨道的特征峰.随着菌体暴露的Cr(VI)初始浓度增加,特征峰强也在增加.由图8所示,Cr2p3/2轨道和Cr2p1/2轨道分别在结合能576～579eV和586～589eV处有明显出峰.根据XPS标准能谱手册可知,Cr2p3/2轨道处的出峰由Cr(VI)在(578.0±0.1)eV 处 的 出 峰 和 Cr(III)在(576.6±0.1)eV处的出峰叠加而成[23].根据Cr2p3/2轨道中峰面积计算分析,当初始浓度为 5mg/L时,Cr(III)/Cr(VI)在菌体表面的比率是1.4:1.此外,Cr2p3/2轨道的两个峰值表示在微生物还原过程中有沉淀物 Cr2O3或 Cr(OH)3形成[24].Cr2p1/2轨道处的出峰由 Cr(VI)在(588.1±0.1)eV 处的出峰和 Cr(III)在(586.6±0.1)eV 处的出峰叠加而成,其结合能比 Cr2p3/2高 10.1eV.由此可知,菌体表面 Cr元素有 Cr(VI)和 Cr(III)两种价态.由于各价态对应峰面积大小不一致,且 Cr(VI)在(588.1±0.1)eV 处的峰面积最小,而其他部分峰相当,所以菌体表面 Cr(III)的含量高于 Cr(VI)的含量.研究结果表明,菌体表面还原反应起到主要作用,并伴随少量的吸附作用.这与汤洁等[16]的结论一致.

图7 S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)的XPS全谱Fig.7 XPS spectrum for S. oneidensis MR-1exposure to Cr(VI)

图8 S. oneidensis MR-1还原Cr(VI)的Cr2p轨道峰Fig.8 XPS spectra of Cr2p for S. oneidensis MR-1exposure to Cr(VI)

3 结论

3.1 Cr(VI)浓度对S. oneidensis MR-1菌株生长有一定的影响,随着Cr(VI)浓度的升高,菌株生长量明显减少.高浓度Cr(VI)降低了S. oneidensis MR-1的Cr(VI)还原率,Cr(VI)可以通过制约菌株生长与活性来抑制Cr(VI)还原.

3.2 S. oneidensis MR-1对Cr(VI)的还原作用随着接种菌悬液量的增加而增强;菌株最适生长pH值为中性,弱碱性环境比酸性环境更有利于菌株对 Cr(VI)的还原;增加Fe(III)的量会加快Cr(VI)被还原的速率.

3.3 扫描电镜能谱分析显示,Cr(VI)被吸附在 S.oneidensis MR-1菌体表面;而高性能X射线光电子能谱分析表明,在S. oneidensis MR-1菌体表面,Cr(VI)被还原成Cr(III).