超微粉碎前处理协同超声波辅助提取香菇多糖工艺研究

秦令祥，崔胜文，周婧琦，高愿军，*

（1.漯河中德双成功能食品研究院有限公司，河南漯河462300；2.漯河食品职业学院，河南漯河462300）

香菇（Lentinus edodes）为担子菌纲、伞菌目、侧耳科真菌，是世界上第二大食用菌种[1]，其营养丰富，味道鲜美，具有很高的药用价值，是一种集营养、保健和药用功效于一体的药食两用真菌[2]，广泛分布我国各省区，在我国有悠久的食用历史，被誉为“山珍之王”，“菌中皇后”[3]，是人类理想的健康食品。

香菇多糖（Lentnan，简称LNT）是从香菇的子实体中分离纯化得到的高分子葡聚糖，主要成分为葡萄糖，还含有少量的甘露糖、岩藻糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖等。香菇多糖是香菇中最重要的一种生物活性物质，是一种重要的生物反应调节剂，具有调节免疫[4]、抗病毒[5]、抗肿瘤、降血糖等作用，目前，已广泛应用于人的临床治疗[6-10]。因此，建立稳定的、高效的香菇多糖提取方法具有重要的现实意义。本研究是利用超微粉碎前处理协同超声波辅助提取香菇多糖，以期能获得一种稳定、高效的提取香菇多糖的方法，为香菇多糖的深入研究与开发获得一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干香菇：丹尼斯超市；葡萄糖、苯酚、硫酸、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450岛津紫外可见分光光度计：深圳市瑞盛科技有限公司；TDL-50B台式低速离心机：上海安亭科学仪器厂；HH-M4数显恒温水浴锅：上海赫田科学仪器有限公司；BSA124S电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；WJW400超微粉碎机：青岛帕罗德粉体设备有限公司；WN-20万能粉碎机：广州旭朗机械设备有限公司；DS-8510DT超声波清洗器：上海生析超声仪器有限公司；W3001全自动智能型激光粒度分析仪：济南微纳仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇粗粉的制备

将从超市中购得的干香菇在80℃烘箱中干燥至恒重，用万能粉碎机粉碎，过60目的筛网，得到符合条件的香菇粗粉，备用。

1.3.2 超微粉碎前处理协同超声波辅助提取香菇多糖方法

将1.3.1所得香菇粗粉，放入超微粉碎机中，参数设置为：进料量800 g，转速5 000 r/min，超微粉碎时间20 min，进行超微粉碎，然后称取不同粒度的超微香菇粉5.000 0 g于锥形瓶中，量取一定量的蒸馏水，进行超声波辅助提取，冷却至室温，离心，取上清液，加入4倍体积的无水乙醇混合，置4℃下醇沉12 h，离心10 min，干燥即得香菇粗多糖。

1.3.3 粒度的测定

取一定量的超微粉碎后的香菇超微粉置于烧杯中，加入一定量95%的乙醇，然后用激光粒度分析仪测定粒度。

1.3.4 香菇多糖提取率的测定

香菇多糖提取率的测定选用苯酚-硫酸法[11]。准确称取烘干并恒重的香菇0.100 0 g，定容在100.00 mL容量瓶中，摇匀，以此作为测定香菇多糖的样品液。再分别吸取2 mL样品液于试管中，用苯酚-硫酸法测定香菇多糖含量。香菇多糖提取率根据下列公式计算。

式中：c为由标准曲线算得的多糖质量浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；N为稀释倍数；m为香菇干粉质量，g。

2 结果与分析

2.1 提取香菇多糖的单因素研究

2.1.1 粉碎粒度大小对香菇多糖提取率的影响

分别采用粉碎粒度为 30、40、50、60、70 μm 的香菇超微粉，设定料液比1∶20（g/mL）、提取时间 30 min，然后测定香菇多糖提取率，结果如图1所示。

图1 香菇粒度对香菇多糖提取率的影响Fig.1 The effect of the ratio of granulesize on extraction yield of lentinan

由图1可以看出，随着香菇粒度的不断增加，多糖提取率不断减小。这可能是由于香菇粒度越小，粉碎程度越高，香菇在粉碎机中受到的剪切、碰撞等作用力越大，进而香菇破壁程度就越高，多糖溶出就越多，多糖提取率就越大。因此，本研究选择最佳香菇粒度为30 μm，此时的多糖提取率为6.89%。

2.1.2 料液比对香菇多糖提取率的影响

分别采用料液比为 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1∶30（g/mL）进行超声波法提取，设定超声温度60℃、超声功率600 W、超声时间20 min，然后测定香菇多糖提取率，其结果如图2所示。

图2 料液比对香菇多糖提取率的影响Fig.2 The effect of the ratio of solid on extraction yield of lentinan

由图2可以看出，随着料液比的增加，香菇多糖提取率先增大后减小。这可能是由于水作为超声波介质，随着料液比的增加，溶剂量增大，超声波介质的液体增多，使香菇多糖物质向外扩散的阻力变小，进而提取率增大，但随着料液比继续增加，水分含量不断增多，香菇原料底物的浓度被稀释，催化反应效率减小，进而提取率降低。因此，本研究选用最佳的料液比为1∶20（g/mL），此时的多糖提取率为6.92%。

2.1.3 超声波功率对香菇多糖提取率的影响

分别采用不同的超声波功率 200、300、400、500、600 W，设定料液比 1∶20（g/mL）、超声温度 60℃、超声时间20 min，然后测定香菇多糖提取率，其结果如图3所示。

图3 超声功率对香菇多糖提取率的影响Fig.3 The effect of ultrasound power on extraction yield of lentinan

由图3可以看出，随着超声功率的增加，香菇多糖的提取率不断增大，这是由于随着超声功率的增大，超声波作用频率、空化、振动作用加强，因而导致提取率提高，但是考虑到过高的超声功率会对多糖分子结构造成破坏使多糖活性降低和能耗等方面的因素，故选用最佳的超声波功率为600 W，此时的多糖提取率为6.97%。

2.1.4 超声时间对香菇多糖提取率的影响

分别采用不同的超声时间 10、20、30、40、50 min，设定料液比1∶30（g/mL）、超声功率600 W，超声温度60℃，然后测定香菇多糖提取率，其结果如图4所示。

图4 超声时间对香菇多糖提取率的影响Fig.4 The effect of ultrasound time on extraction yield of lentinan

由图4可以看出，随着超声时间的不断增加，香菇多糖的提取率先增大后减小，这是由于超声时间的增加，使得香菇多糖结构被破坏，进而降低了多糖提取率。因此，本研究选用最佳的超声时间20 min，此时的多糖提取率为6.93%。

2.2 超微粉碎前处理协同超声波法辅助提取香菇多糖最佳条件的确定

2.2.1 正交试验

以单因素试验为基础，选取粉碎粒度、料液比、超声功率、超声提取时间为试验因素，选取L1（645）进行正交设计，探讨超微粉碎前处理协同超声波辅助法提取香菇多糖工艺的最佳工艺参数。试验水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factor levels table of orthogonal experimental design

2.2.2 正交试验结果

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 The result of orthogonal experimental design

由表2极差分析可知，各因素对香菇多糖提取率的影响大小顺序为：A＞C＞B＞D，从表2的正交试验结果和极差分析可知，因素A第1水平最好，因素B第1水平最好，因素C第3水平最好，因素D第1水平最好，因此最优水平搭配为A1B1C3D1。

2.2.3 香菇多糖提取率方差分析

为进一步确定超微粉碎前处理协同超声波辅助法提取香菇多糖的最佳工艺条件，对试验误差和工艺条件对试验结果的影响进行评估和判断，通过方差分析，结果见表3。

表3 方差分析结果Table 3 The variance analysis results

由表3可以看出，在显著水平P=0.05时，粉碎粒度、料液比和超声功率对香菇多糖的提取率影响较大，达到了显著水平。结合表2的结果，A1、B1、C3水平优于超声时间。由于超声时间的长短对于提取率的影响不是显著因素，对试验结果和数据的影响不大，本着高效、节能、降耗的原则，确定D1为D因素最佳水平。综上分析，确定超微粉碎协同超声波辅助法提取香菇多糖的最佳工艺条件组合为：A1B1C3D1，即粉碎粒度 30 μm、料液比 1 ∶20（g/mL）、超声功率 600 W、超声时间20 min。

2.2.4 验证试验

对通过正交试验得出的最佳工艺条件进行最优化验证试验，3次平行试验的香菇多糖提取率平均值为7.36%，显著高于其他条件下的香菇多糖提取率。

3 结论

本研究采用超微粉碎前处理协同超声波辅助法提取香菇多糖，可显著提高香菇多糖提取率，此法具有条件温和、工艺简单、提取率高的特点。在单因素试验基础上，通过正交试验，得到提取香菇多糖的最佳工艺条件为：粉碎粒度30 μm、料液比1∶20（g/mL）、超声功率600 W、超声时间20 min。在此工艺条件下，香菇多糖的提取率为7.36%。因此，本研究得到的工艺可为香菇多糖的产业化生产以及多糖化合物的综合利用提供理论依据。