紫甘蓝色素提取工艺及其抗氧化活性研究

曹菲菲，康鹏玲，甄润英，*，郝宗锋

（1.天津市食品研究所有限公司，天津301609；2.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；3.天津滨海高新区卫生监督所，天津300384）

天然色素安全性高、色泽自然，而且天然色素在疾病预防和保健方面具有一定的保健功能[1-2]。花色苷能强烈吸收紫外光，在体内起着紫外屏障作用，使细胞分化和其他生命过程正常进行，同时能够预防冠心病和心肌缺损，推迟癌细胞的生长，因此是一种具有较好开发与应用潜力的天然色素[3-4]。目前以花色苷为主要成分的产品投放到市场，用于缓解使用电脑诱发的眼疲劳等症状[5]。

花色苷作为一种天然食用色素，安全、无毒，在食品领域有着巨大应用潜力[6-7]。宋晓波等[8]在紫甘蓝提取色素研究中，在温度55℃、以25%乙醇为溶剂、pH=2的条件下，使用微波辅助萃取法，提取功率在100 W～600 W下测定紫甘蓝色素的吸光度值（A525），随着微波功率的变化，提取液的吸光度值先逐渐升高而后下降，并在功率为300 W时呈现最大值；孙雪花等[9]采用超声波辅助提取法，在以蒸馏水为浸提剂，浸提时间50 min，液固比为 40 ∶1（mL/g），浸提温度为 40℃，超声辅助功率80%时，浸提效果最优。徐亚民等[10]通过普鲁士蓝法来测定总还原力，浓度在0～1 mg/mL时，其还原能力随着其浓度的增加而增强；张会香等[11]采用DPPH自由基的清除试验测定其抗氧化活性，将紫甘蓝鲜样用0.35 mol/L盐酸溶液，按液固比4∶1（mL/g）浸提，在微波炉中以900W功率浸提120s后测吸光度值，当紫甘蓝中花色苷浓度在0.05 mg/mL～0.15 mg/mL时，清除DPPH自由基的清除率随着浓度的升高而增大，当紫甘蓝色素液浓度为0.15mg/mL时，其清除率最大。

本文以鲜紫甘蓝为原料，采用常规水浴提取，使用盐酸水溶液作为提取剂，考察时间、温度、提取剂浓度对浸提效果的影响，进而确定最佳提取条件，并进一步测定提取物的抗氧化活性，以期为紫甘蓝色素的充分开发利用奠定一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

新鲜紫甘蓝：购于天津市王顶堤蔬菜批发市场。

盐酸（分析纯）：Sigma；三（羟甲基）氨基甲烷（Tri-（ hydroxymethyl）aminomethane，Tris-HCl） 缓冲液、邻苯三酚溶液、水杨酸-乙醇溶液、FeSO4溶液、抗坏血酸溶液均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ-2B组织捣碎匀浆机：金坛市荣华仪器制造有限公司；HWS-24电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；DGX-9053B-1电热鼓风干燥箱：上海福玛实验设备有限公司；YP1002N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；WFJ7200可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫甘蓝处理

称取一定质量的新鲜紫甘蓝切块（长×宽=2 cm×2 cm），按1∶1（质量比）的比例加入蒸馏水放于组织捣碎匀浆机中，以10 000 r/min速度打浆3 min，取匀浆，备用。

1.3.2 紫甘蓝色素提取的单因素试验

称取一定质量的紫甘蓝匀浆，然后选用盐酸水溶液作为提取剂，考察提取剂的浓度、提取时间、提取温度对紫甘蓝色素提取效果的影响。

1.3.2.1 盐酸浓度对紫甘蓝色素提取的影响

分别称取9份10g紫甘蓝匀浆置于烧杯中，编号后按匀浆 ∶盐酸=1 ∶5（体积比）加入浓度 0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L 盐酸溶液，在 60 ℃水浴锅中浸提1 h，过滤后取10 mL滤液，用0.05 mol/L的盐酸溶液定容至100 mL，摇匀后测波长在526 nm下的吸光度值。

1.3.2.2 提取时间对紫甘蓝色素提取的影响

分别称取6份10 g紫甘蓝匀浆置于烧杯中，编号后按匀浆∶盐酸=1∶5（体积比）加入0.30 mol/L盐酸溶液，在 60 ℃的水浴锅中分别浸提 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，过滤后取10 mL滤液，用0.05 mol/L盐酸溶液定容至100 mL，摇匀后测波长在526 nm下的吸光度值。

1.3.2.3 提取温度对紫甘蓝色素提取的影响

分别称取6份10 g紫甘蓝浆液置于烧杯中，编号后按匀浆∶盐酸=1∶5（体积比）加入0.30 mol/L盐酸溶液，分别在 30、40、50、60、70、80 ℃的水浴锅中浸提 1 h，过滤后取10 mL滤液，用0.05 mol/L盐酸溶液定容至100 mL，摇匀后测波长在526 nm下的吸光度值。

1.3.3 正交试验

在单因素的基础上，设计了三因素三水平的正交试验，以紫甘蓝色素的吸光度值为指标，对工艺条件进行优化，因素及水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.3.4 提取率计算

根据正交试验得出的最优工艺进行多次重复试验，并对提取物进行浓缩、干燥，称量提取物的重量，然后计算提取率。

式中：A1为提取后样品吸光度值；A0为提取前的样品吸光度值。

1.3.5 紫甘蓝色素提取物抗氧化活性试验

1.3.5.1 紫甘蓝色素提取物对超氧阴离子清除试验

1）邻苯三酚自氧化法：配制浓度分别为 2、4、6、8、10、12、14、16、18 mg/mL 紫甘蓝色素提取物溶液，进行下列抗氧化试验。

2）样品的测定过程：向试管中加入9 mL 50 mmol/L的Tris-Hcl缓冲液，在25℃水浴下保温10 min后加入1 mL蒸馏水，最后加入250 μL 45 mmol/L邻苯三酚溶液，立刻计时。摇匀后，倒入1 cm比色皿中，测定波长在420nm下的吸光度值，记录为A自氧化，然后用1mL待测样品代替1 mL蒸馏水，按上述同样的方法测定吸光度值，记录为A加样。每个浓度组平行测定3次，取其平均值，然后按下式计算抑制率。

1.3.5.2 紫甘蓝色素提取物对羟自由基清除试验

1）水杨酸捕捉羟自由基法：配制浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL紫甘蓝色素提取物溶液，进行下列抗氧化试验。

2）样品的测定过程：分别向5支试管中加入1 mL 8.8 mmol/L FeSO4、1 mL 9.1 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、1 mL样品液和5 mL蒸馏水，再加入1 mL 0.06%H2O2启动反应，立即放入37℃水浴锅中保温30 min后，测定波长在510nm下的吸光度值，记为A1。用1 mL的蒸馏水代替1 mL的H2O2，按上述同样的方法测定吸光度值，记录为A2。用1 mL蒸馏水代替1 mL样品，按上述同样的方法测定吸光度值，记录为A3，每个浓度组平行测定3次，取其平均值，测定结果以清除率表示。

1.3.5.3 IC50的计算

采用Origin软件计算紫甘蓝色素提取物与抗坏血酸对超氧阴离子及羟自由基清除作用的IC50值。

2 结果与分析

2.1 紫甘蓝色素提取的单因素试验结果

2.1.1 盐酸浓度对紫甘蓝色素提取的影响

不同盐酸浓度对紫甘蓝色素提取效果的影响结果见图1。

图1 盐酸浓度对紫甘蓝色素提取液吸光度的影响Fig.1 Effect of hydrochloric acid concentration on absorbance of purple cabbage pigment extract

由图1可知，盐酸浓度在0～0.2 mol/L时紫甘蓝色素提取液的吸光值变化不大，在0.2 mol/L～0.25 mol/L时迅速增大，并且当盐酸浓度为0.25 mol/L时，紫甘蓝色素提取液的吸光度值达到最大，随后呈下降趋势，因此选择浓度为0.25、0.3、0.35 mol/L进行正交试验。

2.1.2 提取时间对紫甘蓝色素提取的影响

不同提取时间对紫甘蓝色素提取效果的影响结果，见图2。

图2 提取时间对紫甘蓝色素提取液吸光度的影响Fig.2 Effect of extraction time on absorbance of purple cabbage pigment extract

由图2可知，紫甘蓝色素提取液的吸光度在0～0.5 h时迅速增大，在0.5 h～1.5 h时紫甘蓝色素提取液的吸光度随着提取时间的增加而缓慢增大，但超过1.5 h后，紫甘蓝色素提取液的吸光度有缓慢下降的趋势，因此，选择1、1.5、2 h进行正交试验。

2.1.3 提取温度对紫甘蓝色素提取效果的影响

不同提取温度对紫甘蓝色素提取效果的影响，见图3。

图3 提取温度对紫甘蓝色素提取液吸光度的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on absorbance of purple cabbage pigment extract

由图3可知，紫甘蓝色素提取液的吸光度在0℃～30℃时迅速增大，在30℃～60℃时紫甘蓝色素提取液的吸光度缓慢增大，并且到60℃时达到最高点，随后呈缓慢下降的趋势，因此，选择40、50、60℃进行正交试验。

2.2 正交试验结果

提取工艺的正交试验结果见表2。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Design and result of orthogonal test

根据表2由极差分析结果可以看出：对紫甘蓝色素提取效果的影响因素主次顺序依次为：提取温度＞盐酸浓度＞提取时间，即提取温度是最主要因素，盐酸浓度是次要因素，提取时间的影响效果不明显。根据正交试验分析得出的最佳组合是A3B3C2，而表中直观分析得到的最佳组合也是A3B3C2。

通过计算得到紫甘蓝色素提取物的提取率为1.67%。

2.3 抗氧化性试验的结果

2.3.1 不同浓度紫甘蓝色素提取物对超氧阴离子清除试验

紫甘蓝色素提取物对超氧阴离子清除效果见图4。

图4 紫甘蓝色素提取物对超氧阴离子的清除能力Fig.4 Scavenging capacity of purple cabbage pigment to superoxide anion

由图4可知，紫甘蓝色素提取物浓度在0～12mg/mL时紫甘蓝色素清除超氧阴离子的能力随着浓度的增加而增大，随后呈下降趋势。

抗坏血酸对超氧阴离子清除效果见图5。

图5 抗坏血酸对超氧阴离子的清除能力Fig.5 Scavenging ability of ascorbic acid to superoxide anion

由图5可知，抗坏血酸浓度在0～0.8 mg/mL时抗坏血酸清除超氧阴离子的能力随着浓度的增加而增大，随后呈下降趋势。

紫甘蓝色素提取物与抗坏血酸清除超氧阴离子的 IC50，见图6。

图6 紫甘蓝色素提取物与抗坏血酸清除超氧阴离子的IC50比较Fig.6 IC50comparison between purple cabbage pigment extract and ascorbic acid scavenging superoxide anion

由图6可以看出，紫甘蓝色素提取物清除超氧阴离子的IC50=2.301 mg/mL，抗坏血酸清除超氧阴离子的IC50=0.029 35 mg/mL。所以，紫甘蓝色素提取物对超氧阴离子的清除能力小于抗坏血酸对超氧阴离子的清除能力。

2.3.2 不同浓度紫甘蓝色素提取物对羟自由基清除试验

紫甘蓝色素提取物对羟自由基清除效果见图7。

图7 紫甘蓝色素提取物对羟自由基清除能力Fig.7 Scavenging capacity of purple cabbage pigment extracts to hydroxyl radicals

由图7可知，浓度在0～0.6 mg/mL的范围内，紫甘蓝色素清除羟自由基的能力随着浓度的增加而增大，随后下降并趋于稳定。

抗坏血素对羟自由基清除效果见图8。

图8 抗坏血酸对羟自由基清除能力Fig.8 Scavenging ability of ascorbic acid to hydroxyl radicals

由图8可知，浓度在0～0.8 mg/mL时，抗坏血酸清除羟自由基的能力随着浓度的增加而增大，到0.8mg/mL后下降。

紫甘蓝色素提取物与抗坏血酸清除羟自由的IC50，见图9。

图9 紫甘蓝色素提取物与抗坏血酸清除羟自由的IC50Fig.9 Purple cabbage pigment extract and ascorbic acid scavenging hydroxyl free IC50

图9可以看出，紫甘蓝色素提取物清除氢自由基的IC50=0.956 9 mg/mL，抗坏血酸清除氢自由基的IC50=0.046 76 mg/mL。所以，抗坏血酸清除羟自由基的能力要比紫甘蓝色素提取物的清除能力强。

2.3.3 抗氧化试验的结果讨论

试验发现，提取物对羟自由基的清除作用比较强，而对超氧阴离子的清除作用比较弱。此外，在相对较低的浓度下，紫甘蓝色素提取物对超氧阴离子和氢自由基的清除作用随着其浓度的增加而明显增强，但是达到一定浓度后对超氧阴离子和氢自由基的清除效果呈缓慢下降趋势。这是因为抗氧化剂本身极易被氧化，若添加过量，被氧化了的抗氧化剂反而可能有助氧化的作用[12-14]。因此，如果作为天然抗氧化剂在实际生产中应用时，要选择适宜的剂量范围，以达到最佳的抗氧化效果。

3 结论与讨论

3.1 提取条件对紫甘蓝色素提取率的影响

盐酸浓度：花色苷在pH≤3的酸性条件下稳定，而当pH值升高时，花色苷会转化为醇型假碱式结构，若pH值再提高，则会导致假碱开环降解，尤其当pH＞7时，极不稳定[15]。因此，紫甘蓝色素适合在酸性条件下浸提。

提取温度：在温度升高的一定范围内，花色苷会向吡喃阳离子转变，而当温度继续升高的时，花色苷极不稳定，因为高温会促使花色苷向假碱式转变以致开环降解[16]。因此，随着温度的变化，紫甘蓝色素提取液的吸光值先逐渐升高，然后下降。

提取时间：随着提取时间的增长，紫甘蓝色素的提取量逐渐增加，且在1.5 h时达到最大，出现这种结果可能是因为在短时间内，60℃保温淀粉不会糊化，随着时间的延长淀粉也会出现糊化现象，淀粉糊化影响花色苷的溶出，从而影响提取效率[12]。

3.2 最终工艺条件的确定

根据表2正交试验结果，直观分析和极差分析即提取温度60℃，提取时间2 h，盐酸浓度为0.3 mol/L的条件下，紫甘蓝色素的提取率为1.67%。

3.3 结论

1）以新鲜紫甘蓝匀浆[紫甘蓝 ∶水=1 ∶1（g/mL）]∶盐酸=1∶5（体积比）加入0.3 mol/L的盐酸溶液，在60℃下浸提2 h，紫甘蓝色素的提取率为1.67%。

2）在浓度0～12 mg/mL范围内，随着浓度的增加，紫甘蓝色素提取物对超氧阴离子的清除能力增强，对超氧阴离子清除能力的IC50为2.301 mg/mL。

3）在浓度0～0.6 mol/mL的范围内，随着浓度的增加，紫甘蓝色素提取物对羟自由基的清除能力增强，对氢自由基清除能力的IC50为0.956 9 mg/mL。

4）紫甘蓝色素提取物对氢自由基的清除效果强于超氧阴离子的清除效果。