大青叶提取物对HepG2细胞酒精性损伤的保护作用

朱俊杰，徐静

（海南大学材料与化工学院，海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海南海口570228）

大青（Clerodendrum cyrtophyllum Turcz）为马鞭草科（Verbenaceae）大青属（Clerodendrum）植物，分布于热带和亚热带地区，在江西、湖南、湖北、广州、海南等地普遍生长，与十字花科菘蓝属大青有别。大青为落叶灌木，又称为羊咩青、路边青、臭大青等。据文献记载[1]，大青全株均具有药用功效，其作用包括缓解牙龈肿痛、解毒利尿、消炎止血等。大青中主要含有黄酮类、萜类、甾醇类及糖苷类化合物，主要活性成分包括山大青苷、类叶升麻苷、连翘苷、没食子酸、鞣质等[2-6]。近年来关于大青的药理研究主要包括抗炎[7]、抗菌[7-8]、镇痛[9]、降压[10]等方面。Zhou 等在先前的研究中[11]，以总黄酮和总酚含量，清除 DPPH·、ABTS+·、·OH 能力，螯合金属离子能力以及还原能力共7个指标，对大青叶的超声辅助乙醇提取的条件进行了优化，并指出石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水相萃取物均具有相应的抗氧化能力。

过量饮酒会引起身体内氧化应激的发生，从而引起脂肪肝和酒精性肝炎，进而诱发肝纤维化、肝硬化、肝癌等一系列病症[12]。酒精性肝病发病率正逐年攀升，已经成为当前威胁公众健康的严重问题，但应对此种病症的治疗手段却捉襟见肘。因此，对酒精性肝病的预防显得格外重要。目前，奶蓟草由于具有清除自由基、抑制脂质过氧化、增加肝细胞蛋白质合成的功效[13]，朝鲜蓟由于对CCl4引起的肝损伤具有保护作用[14]，黄芩、半枝莲和刺五加等植物中具有的黄酮类成分对肝脏具有保护作用[15]，均被制成不同形式的护肝功能性食品，诸如护肝片、护肝胶囊等，作为预防和辅助治疗肝病的食品补充剂。

HepG2细胞具有正常肝细胞的生理功能，又具有癌细胞增殖速度快的特点，因此被广泛应用于肝细胞毒性、肝脂质代谢和体外代谢研究，是从细胞层面研究肝细胞损伤的良好模型。本文利用酒精诱导HepG2细胞损伤建立酒精性肝损伤模型，采用大青叶醇提物以及石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物预处理的方式，研究它们对HepG2细胞的保护作用，为大青叶在功能性保健食品中的应用提供基本依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝癌HepG2细胞株：中国科学院上海细胞库。

大青叶于3月份采自海南省海口市火山群地质公园，经海南大学热带农林学院杨小波教授鉴定为马鞭草科植物大青（Clerodendrum cyrtophyllum Turcz）的叶。

MEM 细胞培养基（minimum Eagle’s medium）：北京中科迈晨科技有限公司；胎牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶（250 U/mg）、BCA 蛋白质定量试剂盒、ECL试剂盒：武汉博士德生物科技有限公司；噻唑蓝 [3-（4，5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2，5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，MTT]：美国 Sigma 公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）测试盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、微量还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）测试盒、细胞丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒：南京建成生物工程研究所；无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亚砜（均为分析纯）：广州化学试剂厂；6/96孔细胞培养板：美国Corning公司。

1.2 仪器与设备

Galaxy R CO2培养箱：英国RS Biotech公司；Infinite M2000 Pro多功能酶标仪：瑞典Tecan公司；SWCJ-2FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；5415R高速冷冻离心机：德国eppendorf公司；VCX细胞破碎仪：美国SONICS公司；HC-500T2高速多功能粉碎机：永康市天棋盛世工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大青叶提取物的制备

大青叶乙醇提取物的制备依照Zhou等[11]的方法。取部分乙醇提取物浸膏，在50℃水浴条件下，用1 000 mL蒸馏水将其溶解，然后顺次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别等体积萃取3次、反萃取1次。萃取所得的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水五相萃取液经旋蒸浓缩后，与剩余乙醇提取物浸膏一起，经冷冻干燥处理得固体粉末，密封后置于零下20℃存放备用。

1.3.2 HepG2细胞的培养

HepG2细胞生长于含有10%（体积分数）胎牛血清的MEM细胞培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中。细胞长满80%左右后进行传代培养。

1.3.3 酒精诱导HepG2细胞损伤模型的建立

参照曹佩琴等[16]的方法并略作修改。将对数生长期的HepG2细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔培养板培养24 h。更换含有不同浓度（0～0.7 mol/L）酒精的培养液继续培养24 h，每个浓度设6个复孔。弃上清液，分别加入 100 μL 含 MTT（1 mg/mL）的培养液，继续培养3 h后，弃上清液，每孔加入200 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），用旋涡振荡器低速振荡10 min溶解，并设置溶剂空白孔（只含有200 μL DMSO），使用酶标仪在570 nm处检测吸光度（A），利用以下公式计算细胞存活率。

1.3.4 大青叶提取物对HepG2细胞毒性的检测

参照曹佩琴等[16]的方法并略作修改。细胞接种于96孔板培养24 h后，更换含有不同浓度（1 μg/mL～10 μg/mL）大青叶醇提物或石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物的培养液处理继续培养24h，每组设6个复孔。弃上清液，用PBS清洗3次。MTT检测方法同1.3.3，并计算细胞存活率。

1.3.5 大青叶提取物抵抗酒精毒性的细胞存活率检测

参照曹佩琴等[16]的方法并略作修改。细胞接种于96孔板培养24 h后，对照组、酒精组更换培养液，提取物各组更换含有不同浓度（1 μg/mL～10 μg/mL）大青叶醇提物或石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物的培养液预处理细胞24 h，每组设6个复孔。随后对照组更换培养液，酒精组和提取物组用含酒精浓度为0.4 mol/L的培养液孵育24 h。MTT检测方法同1.3.3节，并计算细胞存活率。

1.3.6 细胞内ROS含量的测定

ROS含量的检测方法参照试剂盒说明书。细胞接种于96孔板培养24 h，按照1.3.5节经大青叶提取物及酒精处理后，加入DCFH-DA浓度为10 μmol/L的培养液孵育30 min，用PBS洗涤细胞2次，在激发波长500 nm、发射波长525 nm条件下用荧光酶标仪检测荧光强度，利用以下公式计算ROS相对含量。每组均设6个复孔。

ROS相对含量/%=（试验组荧光强度）/（对照组荧光强度）×100

1.3.7 细胞内MDA、GSH、SOD的测定

细胞以2×106个/mL的密度接种于6孔板培养24 h，按照1.3.5经大青叶提取物及酒精处理。依照试剂盒操作说明，使用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH含量，水溶性四唑盐法检测SOD活力，各组中均设6个复孔。使用细胞破碎仪破碎细胞，并用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量。

1.3.8 统计学分析

试验数据表示为平均值±标准偏差，n=6。使用SPSS 19.0统计软件进行One-Way ANOVA分析，p＜0.05为具有显著性差异，Origin 9.0软件作图。。

2 结果与分析

2.1 酒精对HepG2细胞损伤模型的建立

利用MTT法检测发现，如图1所示，使用浓度为0～0.7 mol/L的酒精诱导损伤24 h后，HepG2细胞的存活率逐渐下降，呈浓度依赖性。在0.1mol/L～0.7 mol/L酒精浓度范围内，细胞的存活率便与不含酒精的对照组具有显著差异（p＜0.05）。在酒精浓度达到0.4 mol/L时，细胞存活率降低至50%左右。因此，将诱导HepG2细胞损伤模型的酒精浓度设置为0.4 mol/L。

2.2 大青叶提取物对HepG2细胞的毒性作用

MTT法检测大青叶醇提物和五相萃取物分别在1、5、10 μg/mL 3 个浓度下孵育 HepG2 细胞 24 h 后存活率的影响，结果如图2所示。

图1 不同浓度的酒精对HepG2细胞存活率的影响Fig.1 Cell viability of HepG2 cells following different concentrations of alcohol exposure

图2 大青叶提取物对HepG2细胞毒性的影响Fig.2 Cytotoxicity of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts to HepG2 cells

随着剂量的增加，试验组的细胞存活率稍有下降，但均保持在90%以上。且与对照组相比，试验组的细胞存活率均无明显差异，即未表现出明显毒性作用，因此可在1、5、10 μg/mL浓度下进行细胞保护处理。

2.3 大青叶提取物对酒精诱导HepG2细胞损伤的影响

大青叶提取物对细胞氧化损伤的保护作用见图3。

由图3可知，与对照组相比，酒精组的细胞经过酒精损伤后存活率降低约50%，差异显著（p＜0.01）。与酒精组相比，醇提物预处理后的细胞存活率随着浓度的增加而明显提升（p＜0.01），成浓度依赖性，说明其HepG2细胞的酒精性损伤具有保护作用；石油醚相和二氯甲烷相萃取物预处理后的细胞存活率随着浓度的增加而稍有提升，但无显著差异（p＞0.05），说明其无明显保护作用；乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物预处理后的细胞存活率随着浓度的增加而显著提升（p＜0.01），在 10 μg/mL 浓度下，乙酸乙酯相的提升最明显，水相、正丁醇相次之，且乙酸乙酯相和水相的存活率均高于醇提物的。

图3 大青叶提取物对细胞氧化损伤的保护作用Fig.3 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on HepG2 cells viability in response to alcohol

2.4 大青叶提取物对ROS含量的影响

大青叶提取物预处理对HepG2细胞内ROS的影响见图4。

图4 大青叶提取物预处理对HepG2细胞内ROS的影响Fig.4 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on the level of ROS in HepG2 cells induced by alcohol

如图4所示，经浓度为0.4 mol/L的酒精处理24 h后，HepG2细胞内ROS的生成量较对照组明显上升（p＜0.01）。而在使用10 μg/mL浓度的醇提物和二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物预处理后，与酒精组相比，ROS的生成量明显降低（p＜0.05），石油醚相的没有明显变化。并且，乙酸乙酯相的ROS水平要低于醇提物的。

2.5 大青叶提取物对细胞内MDA含量的影响

大青叶提取物预处理对HepG2细胞内MDA的影响见图5。

图5 大青叶提取物预处理对HepG2细胞内MDA的影响Fig.5 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on the level of MDA in HepG2 cells induced by alcohol

如图5所示，与对照组相比，酒精组细胞内MDA生成量明显升高（p＜0.01），说明0.4 mol/L酒精能够诱导细胞发生严重的脂质过氧化。但在给予10 μg/mL浓度的醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物预处理后，与酒精组相比，MDA的生成量明显降低（p＜0.05），石油醚相及二氯甲烷相的没有明显变化。乙酸乙酯相保护细胞免受脂质过氧化的能力要高于醇提物，正丁醇相和水相的能力与醇提物相当。

2.6 大青叶提取物对细胞内GSH含量的影响

大青叶提取物预处理对HepG2细胞GSH的影响见图6。

图6 大青叶提取物预处理对HepG2细胞GSH的影响Fig.6 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on the levels of GSH in HepG2 cells induced by alcohol

如图6所示，酒精处理24 h能使HepG2细胞内GSH含量骤然降低，说明细胞为抵御就近的刺激消耗了大量GSH。在经过醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物预处理的细胞内，与酒精组相比，GSH的损失量明显减少，尤其是乙酸乙酯相的最为明显（p＜0.01），醇提物、水相、正丁醇相次之，石油醚相、二氯甲烷相无显著效果（p＞0.05）。

2.7 大青叶提取物对细胞内SOD活力的影响

大青叶提取物预处理对HepG2细胞SOD的影响见图7。

图7 大青叶提取物预处理对HepG2细胞SOD的影响Fig.7 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on the levels of SOD in HepG2 cells induced by alcohol

如图7所示，与对照组相比，酒精组细胞内SOD活力明显下降（p＜0.01），表示0.4 mol/L的酒精可以导致HepG2细胞抗氧化能力下降。与酒精组相比，醇提物预处理可以使细胞内SOD活力明显提升（p＜0.05）；萃取物中，乙酸乙酯相预处理所提升的SOD活力最强，水相、正丁醇相次之；石油醚相和二氯甲烷相无明显改善效果（p＞0.05）。

3 讨论与结论

过量饮用含酒精的饮料时，酒精作为氧化剂会对身体造成一定的伤害。在酒精的代谢过程中累积产生的ROS会抑制谷胱甘肽的合成，从而破坏人体内的抗氧化机制，同时会引起细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，生成对机体具有损伤作用的脂质过氧化产物MDA[17]。MDA因此作为生物体脂质过氧化的标志物。研究通过MTT法首先检测不同浓度酒精诱导HepG2细胞损伤的程度，发现HepG2细胞的存活率随着酒精浓度的增加而降低，呈浓度依赖性，并且浓度为0.4 mol/L时存活率减半。然而，使用不同质量浓度的大青叶醇提物预先处理24 h后，HepG2细胞的存活率较未预先处理的酒精损伤细胞明显提升（p＜0.01），乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物具有同样作用效果，乙酸乙酯相所提升的细胞存活率尤为明显，高于醇提物，石油醚相和二氯甲烷相萃取物无明显作用效果。同时发现，HepG2细胞暴露于酒精（0.4 mol/L）24 h后，细胞内的ROS水平明显升高（p＜0.01），而预先用大青叶醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物处理HepG2细胞后，ROS的生成得到明显的抑制（p＜0.01），抑制能力乙酸乙酯相＞水相＞醇提物＞正丁醇相，石油醚相和二氯甲烷相无明显抑制作用。酒精刺激后的HepG2细胞内MDA含量增加近一倍，预先用大青叶醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物处理可以降低其生成量，乙酸乙酯相的作用效果最为明显，石油醚相和二氯甲烷相无明显效果。大青叶提取物之所以表现出抑制细胞内ROS和MDA的生成的能力，可能是由于其含有较多的酚类、黄酮类以及苯乙醇苷类等具有较强抗氧化活性的化合物[18]。已有相关文献指出[16，19]，植物中的抗氧化剂能够减少肝细胞中ROS的生成，从而减少由其引发的细胞脂质过氧化，防止氧化应激的产生。

酒精在机体内代谢过程中产生的中间体乙醛是一种高活性分子，同样能引起细胞的脂质过氧化，可能与脂质过氧化产物一起导致肝细胞以及其他组织的损伤[20]。更为重要的是，乙醛与巯基具有高亲和力，这种特性使它能与抗氧化酶上的巯基结合形成席夫碱，从而削弱人体内抗氧化酶的抗氧化能力，这些抗氧化酶包括SOD、CAT、GSH-Px等[21]。SOD是细胞内抵抗氧化应激的只要抗氧化酶，它能将氧化应激产生的处于活跃状态的超氧化物转化为毒害较弱的过氧化氢，再通过CAT和GPx将其分解成水和氧[22]。GSH是细胞内抵抗ROS的主要抗氧化分子之一。GSH在GST的催化作用下能与细胞内有害物质结合，再经由细胞膜被排出[23]。本试验中，酒精的诱导能显著降低HepG2细胞内SOD活力和GSH含量，指示细胞内的抗氧化系统已经失衡，使其遭受了严重氧化损伤。但在大青叶醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物预处理后，损伤细胞内的SOD活力、GSH含量得到不同程度的提升，指示它们能够抵御酒精造成的氧化损伤，帮助HepG2细胞恢复抗氧化机制，增强抗氧化能力。石油醚相和二氯甲烷相无明显改善作用。

大青叶醇提物对酒精性肝损伤具有保护作用，其作用机制依赖于所具有的抗氧化活性。乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物是大青叶醇提物的有效部位，其中乙酸乙酯相萃取物的肝细胞保护作用最强，可以作为今后重点研究对象。本试验为大青叶作为具有抗氧化能力、护肝作用的保健食品提供了一定的理论研究依据。