激素和叶面剪除对莲藕实生苗不定根形成及POD活性的影响

蒋润枝， 马翠亭， 冯先楚， 杨蒙立， 程立宝

(扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009)

莲藕(NelumbonuciferaGaertn)是睡莲科(Nymphaeaceae)莲属多年生水生草本植物，在我国有3 000多年的栽培历史[1]，是我国主要水生蔬菜之一，以膨大根状茎(俗称藕)供食用，其营养丰富，深受群众喜爱，是我国主要出口创汇型蔬菜之一[2]。莲藕根系不发达，不定根的形成直接影响莲藕植株的后期发育。因有性繁殖的实生苗幼苗期较长，发育迟缓，影响植株后期的生长发育，所以目前生产上通常采用无性繁殖的繁殖方法。通过杂交产生变异，再通过无性繁殖固定变异是莲藕新品种创制的主要途径，也是莲藕新品种培育的主要手段，但通过有性杂交获得的莲藕实生苗不定根发生量较少，导致苗期较长、植株当年不能开花，进而影响形成生产用种藕或商品藕。因此，发掘莲藕实生苗不定根形成过程激素调控机制，是加速莲藕新品种选育、缩短育种年限的有效途径，也为加速莲藕种质创新和新品种选育奠定重要基础。

吲哚乙酸(IAA)作为生长素中最重要的一种内源激素，参与植物发育的诸多过程，调控多种生理反应。研究表明一定浓度的IAA可以显著促进作物根系的生长发育[3-5]。过氧化物酶(POD)是IAA分解代谢的关键酶，在IAA分解代谢过程中起着关键作用，许多研究发现POD参与IAA的分解，植物的POD通过催化IAA氧化脱羧来调节植物体内的生长素水平，从而保持植物的正常生长发育[6]。乙烯能够促进果实成熟并具有对幼苗生长的“三重反应”(抑制茎的伸长生长、促进茎或根的增粗与促进茎的横向生长)，此外它还具有诱导不定根和根毛的发生、促进叶片衰老、打破种子和芽的休眠及促进器官脱落等功能。目前，相关研究表明乙烯在不定根形成方面的影响主要有促进[7-9]、抑制[10]和不作用[11]3种观点。叶片剪除处理对植物的生长发育起到一定的促进作用。梁娴等研究了在不同剪除方式下，草坪黑麦草根系活性的变化，适当的剪除次数和修剪高度能够促进草坪黑麦草根系活性的升高，说明剪除处理能够促进地下根系的生长[12]。陈龚的研究表明，在一定程度上提高剪叶程度和次数，可明显提高烟苗根鲜质量、根干质量、总根长、根表面积及二级侧根数[13]。

目前有关莲藕实生苗不定根生长发育的研究较少，乙烯、生长素和叶片剪除方式对实生苗形成和POD活性的影响尚无报道，本试验研究了乙烯利、生长素和叶片剪除处理之后的莲藕实生苗不定根形成和对POD活性的影响，为深入解析莲藕不定根形成的激素调控机理及种质改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

1.1.1 乙烯和生长素对莲藕实生苗不定根形成的影响 试验材料为江西太空莲，在扬州大学园艺与植物保护学院的RXZ-300D智能人工气候箱中培养，白天温度30 ℃，夜间温度24 ℃，湿度70%；该试验于2015年7月至2017年10月开展。待莲籽(已破壳)充分吸水发芽后，即2张子叶之间有裂缝时，选取长势一致的实生苗放置于塑料盒(长22 cm×宽 15 cm×高16 cm)中。利用不同浓度的IAA、TIBA、乙烯利和1-MCP(表1)处理莲藕实生苗3 d后置于清水中培养，每2 d更换1次清水。每个处理3个重复，每个重复50株。

表1 不同溶液处理浓度

1.1.2 叶片剪除处理对莲藕实生苗不定根形成的影响 将已破壳的江西太空莲莲籽放在玻璃瓶(上口直径5.5 cm，下口直径6.5 cm，高7 cm)中培养，待莲籽实生苗长至5～7 cm时，对实生苗进行剪除处理。此处理包括水面以上叶片剪除和水面以下叶片剪除2个处理(图1)。水面以上剪除处理：用剪刀将实生苗的叶片和部分叶柄剪去，剪留叶柄长度高于水面2 cm左右。水面以下剪除处理：在实生苗叶柄的3～4 cm 处用剪刀将上部叶片和叶柄剪除，并将剪口处用塑料薄膜封住，以防止水灌入叶柄。在2次剪除处理后(早、晚各1次)进行第1次取样，待水面以上剪除处理的莲藕实生苗长出不定根后进行第2次取样。

1.1.3 不定根数量的测定 待莲藕实生苗长出不定根之后，统计根长≥0.5 mm的所有不定根数量，计算生根率：

生根率=生根种子个数/总个数×100%。

1.2 试验仪器与试剂

本试验中所用到仪器包括酶标仪、离心机；本试验中所用到的主要试剂包括过氧化物酶(peroxidase，POD)试剂盒(购自苏州科铭生物技术有限公司)。

1.3 POD活性测定

使用过氧化物酶试剂盒测定样品中过氧化物酶的活性。按照组织质量(g) ∶提取液体积(mL)为1 g ∶10 mL的比例，称取0.1 g混样，加入1 mL提取液，进行冰浴匀浆，10 000g4 ℃离心10 min，去上清，置冰上待测。测定步骤如下：

在微量石英比色皿或96孔板中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录470 nm下30 s时的吸光值D1和1 min 30 s后的吸光值D2。

(1)分光光度计或酶标仪预热30 min以上，调节波长至470 nm，蒸馏水调零。

(2)测定前将试剂一、二和三室温放置10 min以上，然后进行如下操作(表2)。

表2 样品测定

(3)POD活性的计算。

单位定义：1 g组织在1 mL反应体系中1 minD470 nm变化0.01为1个酶活性单位。

POD(U/g)=ΔD×V反总÷(m×V样÷V样总)÷0.01÷t=2 500×ΔD÷m。

式中：V反总表示反应体系总体积，mL；V样表示加入样本体积，mL；V样总表示加入提取液体积，mL；t表示反应时间，min；m表示样本质量。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel、SPSS 16.0软件中One-Way ANOVA分析Duncan’s法(P<0.05)进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 IAA对莲藕实生苗不定根形成的影响

2.1.1 不同浓度IAA处理对莲藕实生苗不定根数量的影响 不同浓度的生长素对莲藕实生苗不定根形成的效果不同。从图2中可以看出，莲藕实生苗经低浓度的IAA处理后，能显著促进不定根数量的增加，其中15 μmol/L IAA处理效果好于75、125、175 μmol/L IAA 处理。利用15、75 μmol/L IAA处理后，在调查时间内实生苗不定根形成数量始终显著高于对照，而125 μmol/L IAA处理在后期促进效果不明显，后期甚至出现显著下降趋势；利用175 μmol/L IAA处理实生苗后1～6 d发现，不定根形成的数量极显著低于对照。以上试验结果表明，低浓度的生长素促进莲藕实生苗不定根的形成，而高浓度的生长素则抑制不定根的发生。

2.1.2 不同浓度IAA处理对莲藕实生苗不定根生根率的影响 表3为不同浓度IAA处理后莲藕实生苗在6 d内生根率的变化，从表3可看出，不同浓度IAA处理后的实生苗与对照组相比，15 μmol/L IAA效果最好，在5 d时生根率已达100%，生根率显著高于对照。75、125 μmol/L IAA在 1～3 d有显著促进作用，在4、5 d时，75 μmol/L IAA处理较对照相比效果不明显。125 μmol/L IAA在4 d时，较对照相比差异不显著，而在5、6 d时，呈显著负增加的趋势。175 μmol/L IAAIAA处理后显著抑制了实生苗的不定根生根率。

表3 不同浓度IAA处理后莲藕实生苗生根率的变化

注：同列数据后不同小写字母表示差异达到0.05显著水平，相同小写字母表示在0.05水平上差异不显著。下同。

2.2 TIBA对莲藕实生苗不定根形成的影响

2.2.1 不同浓度TIBA处理对莲藕实生苗不定根数量的影响 与IAA处理效果相反，不同浓度TIBA处理莲藕实生苗后均对不定根数量产生抑制作用，抑制效果15 μmol/L好于10、5 μmol/L(图3)。5、10 μmol/L TIBA处理后，莲藕实生苗在1～4 d(2 d除外)不定根数量较对照相比显著减少，6 d时，抑制效果达到极显著水平。15 μmol/L TIBA在调查期内始终极显著地抑制了藕实生苗不定根的形成。

2.2.2 不同浓度TIBA处理对莲藕实生苗不定根生根率的影响 从表4可看出，经TIBA处理后，莲藕实生苗的生根率与对照组相比呈显著下降的趋势。利用5、10、15 μmol/L TIBA处理后，生根率在1～6 d都显著降低，随浓度的增加抑制效果越明显，当对照生根率达100%时，5、10、15 μmol/L 处理的生根率仅达86%、79%、61%(第5 d)。

表4 不同浓度TIBA处理后莲藕实生苗生根率的变化

2.3 乙烯利对莲藕实生苗不定根形成的影响

2.3.1 不同浓度乙烯利处理对莲藕实生苗不定根数量的影响 利用不同浓度(100、200、300 mg/L)的乙烯利处理莲藕实生苗，结果如图4所示。100 mg/L乙烯利处理后，与对照相比，不定根形成数量在1～3 d差异不显著，4～6 d时，促进效果达到显著水平；200、300 mg/L乙烯利处理在1～3 d时显著促进不定根的形成，4～6 d时，促进效果达到极显著水平。以上结果表明，一定浓度的乙烯利能够促进莲藕实生苗不定根数量的增加。

2.3.2 不同浓度乙烯利处理对莲藕实生苗不定根生根率的影响 由表5可知，与对照相比，一定浓度的乙烯利能够提高莲藕实生苗不定根的生根率。在整个调查期间，其中 200 mg/L 乙烯利对生根率的促进效果最佳，6 d时莲藕实生苗生根率已达100%，与100 mg/L乙烯利之间差异显著，与300 mg/L乙烯利之间差异不显著。

表5 不同浓度乙烯利处理后莲藕实生苗生根率的变化

2.4 1-MCP对莲藕实生苗不定根形成的影响

2.4.1 不同浓度1-MCP处理对莲藕实生苗不定根数量的影响 利用100、200、300 mg/L 1-MCP处理莲藕实生苗，研究其对莲藕实生苗不定根形成的影响。结果表明，100、200、300 mg/L 1-MCP在调查时间内，均能显著抑制不定根的生成，且200、300 mg/L 1-MCP的抑制效果好于100 mg/L(图5)，说明降低植物体中内源乙烯含量能抑制不定根的形成。

2.4.2 不同浓度1-MCP处理对莲藕实生苗不定根生根率的影响 由表6可知，1-MCP处理后莲藕实生苗的生根率在调查时间内显著降低。当对照的生根率达100%时(5 d)，1-MCP处理过的实生苗生根率分别为85%、67%和70%。从作用效果来讲，200、300 mg/L抑制作用好于 100 mg/L，200 mg/L 和300 mg/L之间无显著差异。

2.5 叶片剪除处理对莲藕实生苗不定根的影响

2.5.1 叶片剪除处理对莲藕实生苗不定根数量的影响 水面以上叶片剪除处理和水面以下叶片剪除处理对影响莲藕实生苗不定根形成的效果不同。图6表明，与对照相比，水面以上叶片剪除处理显著促进了实生苗不定根的形成，叶片水面以下剪除反而抑制了实生苗不定根的形成。

表6 不同浓度1-MCP处理后莲藕实生苗生根率的变化

2.5.2 叶片剪除处理对莲藕实生苗不定根生根率的影响 由表7可知，叶片水面以上剪除处理显著高于对照和叶片水面以下剪除处理。叶片剪除处理4 d，水面以上剪除处理生根率达100%，对照生根率为38.4%，而水面以下处理只有0，说明不同的叶片剪除方式对不定根的形成具有很大的影响(表6)。

表7 叶片剪除处理对莲藕实生苗的生根率的影响

2.6 不同处理对莲藕实生苗POD活性的影响

从图7可知，经过IAA和ETH处理的植株在24 h内POD活性均呈现先升高后降低的趋势(图7-A、图7-C)，而TIBA、1-MCP和对照组植株POD活性一直保持升高趋势(图7-B、图7-D)。其中12 h时，1-MCP、IAA、TIBA、乙烯利处理的POD活力无明显差异，但显著高于对照，而在24 h时，POD活性大小依次为TIBA>1-MCP、对照>乙烯利>IAA处理，说明乙烯利和IAA均能改变植株体内POD活性。

从图7-E可知，对照POD活性呈现先下降后上升最后下降的趋势，而叶片水面以下剪除POD活性一直高于叶片水面以上剪除POD活性。从图7-F可知，在莲藕实生苗长出不定根后，对照POD活性呈现先下降后上升的趋势；叶片水面以上剪除POD活性呈现出显著高于叶片水面以下剪除POD活性而后低于叶片水面以下剪除POD活性的趋势。

3 结论

本研究发现，15 μmol/L IAA能够显著提高莲藕实生苗不定根数量和生根率，而175 μmol/L IAA处理后显著抑制了实生苗的不定根的数量和生根率，这表明低浓度的生长素对不定根起到促进作用，而高浓度的生长素则抑制不定根的发生。一定浓度的乙烯利能够促进莲藕实生苗不定根数量和生根率的增加，200、300 mg/L乙烯利效果最佳。植株叶片剪除处理对不定根有一定影响，与对照相比，水面以上剪除可以显著促进莲藕实生苗不定根的生长发育，水面以下剪除起到一定的抑制作用。由以上结论推测，POD可能通过影响生长素含量来影响植株的生长发育。

4 讨论

裴东等研究发现，在培养基中加入一定水平的IBA能够诱导核桃子叶产生不定根[14]。江玲等发现，利用适宜浓度的吲哚乙酸处理莴苣幼苗的根部20～30 h，可促进大量侧根原基启动和突起[15]。王金祥研究表明，利用100 μmol/L乙烯利处理大豆插条，对其不定根的形成有一定促进作用[16]；而孙逸超研究表明，5 μL/L 1-MCP可显著抑制绿豆下胚轴不定根的发生[17]。以上报道与本试验结果相似，本研究发现 10 μmol/L IAA能够显著促进莲藕实生苗不定根的形成。另外一定浓度的乙烯利也能够促进莲藕实生苗不定根的形成，这与谢阳姣等的试验结果[7]相似。刘国顺等在烤烟漂浮育苗中发现，通过剪叶处理可以显著提高根系活性，暗示剪叶处理较未剪叶的对照相比，能明显地促进根系的生长发育[18]，这与吕芳等的研究结论[19]相一致。本试验对莲藕实生苗进行剪叶处理后，能显著增加实生苗不定根数目和提高生根率，说明剪叶处理对莲藕实生苗不定根的形成有显著促进作用。但凌启鸿等的研究表明，在越冬前对小麦进行剪叶处理，不仅明显减少了分蘖穗数和每株穗数，且对次生根数有一定的抑制作用[20]，说明不同物种的叶面剪除效果可能不同。

外源刺激可导致植物体内POD活性发生变化，这与物种种类、生长习性等有关。廖祥儒等研究发现，用甘露醇和 6-BA 处理水稻后，明显降低了POD的活性[21]。在小麦干旱胁迫研究试验中，陈军等研究发现小麦萌发期在0～120 h期间，5%、15% PEG-6000胁迫下小麦POD活性呈逐渐上升趋势，但15% PEG-6000胁迫下小麦POD活性比5% PEG-6000胁迫下其活性增幅大，25%、35% PEG-6000胁迫下小麦POD活性表现为先上升后下降[22]。但也有研究发现，干旱胁迫下，荔枝叶片细胞胞质以及与壁以离子键和与壁以共价键结合的POD和IAA氧化酶(比)活性均上升，IAA氧化酶和POD(比)活性的增加，引起IAA含量下降[23]。本试验利用乙烯利、生长素处理莲藕实生苗，发现在24 h内POD活性呈现先上升后降低的趋势，而叶片水面以上剪除也得到相似的结果，说明POD活性可能与不定根的形成相关，但这种相关性是否和实生苗内源IAA含量有关还有待进一步验证。