烟草新型体细胞胚结构类蛙卵体的诱导发生

吴建新，徐克东，王 伟，李成伟,4*，吴建宇

(1.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002； 2.周口师范学院 植物遗传与分子育种重点实验室，河南 周口 466001； 3.河南省作物分子育种与生物反应器重点实验室，河南 周口 466001；4.河南科技学院，河南 新乡 453003)

植物体细胞胚发生(Somatic embryogenesis, SE)是植物体细胞经诱导或自发，重新编程其发生发育，转化为胚性细胞，并进一步分化为体细胞胚的无性繁殖过程。植物体细胞胚属于非合子胚，多起源于单细胞，异于无融合生殖胚，并区别于植物组培器官发生过程中芽与根的分化[1]。体细胞胚结构具有发育两极性[2]、高度敏感性、生理隔离性(可自然脱毒)、相对稳定的遗传性(再生植株变异率低)、高效再生性、发育重演性、适于悬浮培养，以及转化无嵌合等优点[3-6]。在基础研究方面，体细胞胚是研究合子胚发育的理想试验模型，具有合子胚无法比拟的可排除非胚性母体组织影响的优势[7-8]。在植物体细胞胚的应用研究方面，体细胞胚是高效遗传转化体系、无性变异株系获得[7]、体细胞杂交种资源创制、人工种子制备、种质资源保存等研究的关键。植物高频再生体系是高效遗传转化体系构建的重要前提，高效率的体细胞胚发生体系作为植物高频再生体系的重要途径之一，对于高效植物转化体系的构建也至关重要。同时，高效率的体细胞胚发生体系也是植物干细胞生物反应器构建的重要研究基础[3,5]。

自Steward等[9]、Reinert等[10]建立胡萝卜体细胞胚发生体系以来，研究者已在多种被子植物、裸子植物和蕨类植物的组织、悬浮细胞系和原生质体培养过程中成功诱导出了大量体细胞胚结构。植物体细胞胚发生的常规结构主要包括以下3种。(1)典型SE结构。如双子叶：原胚-球形胚-心形胚-鱼雷胚-子叶胚；单子叶：原胚-球形胚-梨形或盾形胚；裸子植物：早期胚-晚期胚-子叶胚[2]；蕨类植物：线性原胚-早期胚叶-晚期胚叶[11]，或直接与间接绿球体(Green globular body,GGB)[12]；(2)兰科类原球茎(Protocorm-like body,PLB)结构；(3)蔷薇属PLB结构[13-14]。为了更好地开展植物体细胞胚发生方面的研究，尤其是为了组建高效的植物干细胞生物反应器，笔者在国际上首次命名、报道了3种新型的植物体细胞胚结构，分别为类蛙卵体(Frog egg-like body,FELB)[3,5]、类块根体(Rhizoid tubers,RTB)[4]、类珠芽体(Bulbil-like body,BLB)[6]等。烟草是茄科的代表植物，也是植物学等相关研究的经典模式材料。在基因工程研究方面，研究者利用转基因的方法，将外源基因导入烟草中，通过种植大面积的转基因烟草，生产所需的疫苗或蛋白质类药物，如Ebola Zaire疫苗[15-16]的开发。然而，转基因烟草干细胞系的发酵培养与大面积种植转基因烟草相比，更利于疫苗、抗菌肽、植物源功能蛋白质等基因工程产品的规模化生产、富集、纯化与开发。因此，在烟草中，成功构建一种利于其干细胞挖掘与分离的体细胞胚发生结构显得尤为重要，该技术体系也将为其他植物尤其是我国传统名贵中草药的植物源活性物质干细胞生物反应器[17-18]的构建提供研究策略与思路。

1 材料和方法

1.1 植物材料的培养

选取种皮完整、颗粒饱满的烟草(Nicotianatabacumvar W38)种子，于超净工作台中经75%乙醇表面消毒30 s至1 min，无菌水冲洗3次，2.5%次氯酸钠溶液消毒8～10 min，无菌水冲洗3～5次。将烟草种子播于1/2MS+10 g/L蔗糖(pH值5.8～6.06)的培养基上，16 h光照[150 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗，(25±1)℃，培养20 d后可得到长势良好的烟草无菌苗。

1.2 FELB诱导发生

在MS培养基中添加不同质量浓度的生长素类物质NAA与2,4-D(0、5、10、15 mg/L)，其中含50 g/L蔗糖、7.8 g/L琼脂粉，pH值5.80～6.06。培养基在0.15 kPa，121 ℃条件下湿热灭菌20 min。取烟草无菌苗的根、茎和叶于无菌水中，将根、茎切成1 cm左右的茎段，叶片切至1 cm×1 cm左右的叶盘，置于无菌的滤纸上吸干多余水分。将叶片(近轴面向上)，茎段与根段(不考虑极性方向)平铺于培养皿中诱导培养基上，再将培养皿分别于光照[150 μmol/(m2·s)]、黑暗条件下，(25±1)℃进行FELB诱导培养。

1.3 FELB胚体萌发再生诱导

在MS培养基中添加不同质量浓度的BAP(0、0.5、1.0、1.5 mg/L)，其中含30 g/L蔗糖、7.8 g/L琼脂粉，pH值5.80～6.06。培养基在0.15 kPa、121 ℃条件下湿热灭菌18～20 min。将与母体分离的FELB个体(离体处理)或未与母体分离的FELB(原位处理)分别进行胚体萌发再生诱导。并于16 h光照[120 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗，(23±1)℃条件下进行胚体萌发培养。

1.4 丛生芽生根诱导

以1/2MS为基本培养基，加入10 g/L蔗糖、0.5 mg/L NAA、1 mg/L GA3，调节pH值5.80～6.06，并添加7.8 g/L琼脂粉。培养基在0.15 kPa、121 ℃条件下湿热灭菌18～20 min。待丛生芽生长至1～2 cm后，将其分株切下，置于生根培养基中，于16 h光照[150 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗，(25±1)℃条件下进行生根培养。

1.5 FELB起源的组织学分析

将愈伤组织与不同发育时期的FELB结构于4%的多聚甲醛固定液[溶解于100 mmol/L的PBS(Phosphate buffer solution)，pH值7.2]中固定48～72 h。然后，分别采用50、100 g/L的蔗糖溶液脱水24～36 h。采用OCT(Optimum cutting temperature compound)包埋剂包埋。最后，采用冷冻切片机(CM1850，徕卡显微系统有限公司，德国)将材料切成8～10 μm的切片，置于载玻片上，采用光学显微镜(Olympus BX 41)进行阅片镜检。

1.6 FELB结构的胚性组化分析

通过双染色法(伊文斯蓝和醋酸洋红)[3-5,19]，对所诱导的外植体(含有母体组织、特殊愈伤组织与FELB)进行双染色胚性鉴定。利用单反相机(Canon 600 D)进行拍照。

1.7 数据统计分析

烟草的特殊愈伤组织、FELB结构的诱导发生概率与FELB胚体萌发发生概率数据均采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析与差异显著性检测(ANOVA分析；99%和95%置信区间)[3-4,20]。

2 结果与分析

2.1 FELB结构的诱导

黑暗条件下，烟草的不同外植体(根、茎、叶)在含有10 mg/L 2,4-D的诱导培养基中诱导7 d后，外植体边缘均出现了少量黏稠、透明的特殊愈伤组织(图1B、C)，其中，叶片外植体的特殊愈伤诱导率可达100.00%，明显高于根与茎段外植体的诱导效果(表1)。这与龙葵[3]、蔊菜[5]的FELB诱导过程中出现的特殊愈伤组织相同。14 d后在特殊愈伤组织中形成了浅色的类蛙卵状体细胞胚结构[3](图1G)。在3种外植体中，叶片的诱导效果最佳，FELB诱导率可至97.77%，茎段次之(75.90%)，根的诱导效果较差(71.40%)(表2)。而3种外植体在添加不同浓度NAA的培养基中均未能成功诱导出FELB结构。并且，在光照条件下，不同浓度的2,4-D与NAA的所有处理亦未能诱导出FELB结构。当生长素类似物2,4-D的质量浓度高于或小于10 mg/L时也可以诱导出特殊愈伤组织和FELB，但是数量明显减少(表2)。经过胚性鉴定的双染色(伊文斯蓝和醋酸洋红)处理可以发现，胚性细胞被染成浅色，而非胚性组织被染成了深色(图1H与I)。

A．叶片外植体，bar=1 cm； B．7 d后形成少量愈伤，bar=1 cm； C．B图局部放大，bar=0.5 cm； D．10 d形成少量FELB，bar=1 cm；E．D图局部放大，并具有透明的粘性愈伤组织，bar=0.25 cm； F．诱导15 d后的FELB，bar=1 cm；G．F图局部放大，示发育中的FELB，bar=0.25 cm； H．25 d后形成大量FELB，经伊文斯兰与醋酸洋红双染色，浅色为FELB胚体，深色为非胚性组织，bar=1 cm； I．H图局部放大，bar=0.25 cm图1 烟草W38叶片外植体FELB结构的诱导发生

表1 2,4-D对烟草根、茎、叶外植体特殊愈伤组织诱导率的影响%

注：愈伤组织诱导率是指产生愈伤组织的外植体总数与所有接种的烟草外植体总数之比。每个外植体单个处理组的平均值和标准差均由30个培养皿中的300个外植体(即30个重复)统计获得；大、小写字母分别表示在1%、5%的置信区间具有显著差异，下同。

2.2 再生与生根诱导

将FELB外植体(离体与原位处理)转移到再生培养基上诱导7 d后，其颜色由无色逐渐转变为浅色(图2G)，体积增大。诱导约10 d之后FELB的颜色变为深色(图2H)，15 d诱导出丛生芽(图2I)。

在光照条件下，不同质量浓度BAP(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)均可诱导FELB结构完成胚体萌发成苗(图2G—J)。其中，2.0 mg/L BAP的诱导效果最佳，对根、茎、叶外植体所产生FELB结构的胚体萌发诱导率分别可至29.53%、15.27%、67.07%(表3)。而在黑暗条件下未能成功诱导FELB出苗。

表2 2,4-D对烟草根、茎、叶外植体FELB诱导率的影响 %

注：FELB诱导率是指产生FELB结构的外植体总数与所有接种的烟草外植体总数之比。

A．叶片外植体； B．A图的局部放大，示FELB结构(诱导10 d)； C．离体FELB； D和E．不同发育阶段FELB的醋酸洋红染色；F．不同发育阶段FELB的形态； G，H，I和J．FELB的再生诱导； K．FELB再生植株；L和O．再生植株单花和花序； N．再生植株的未成熟果实； M．再生植株的成熟种子图2 烟草FELB结构的发育流程与植株再生

表3 BAP对不同烟草外植体FELB胚体萌发再生率的影响%

注：FELB胚体萌发再生率是指发生胚体萌发的FELB结构总数与所有进行胚体萌发再生的烟草FELB总数之比。

2.3 FELB结构的组织细胞学分析

烟草FELB结构的发生发育流程主要历经2个重要标志阶段，即球形胚(图3C)和心形-鱼雷过渡胚(图3D)。在FELB的发生过程中，最先诱导出来的是透明状的特殊愈伤组织，其结构比较疏松，致密性差(图3A)。随着愈伤组织的增多，致密的细胞快速分裂区(FCDZ，即Fast-cell-division zone)[4]开始出现，FELB的细胞组成比较密集、紧凑(图3B、C)。通过冷冻切片观察和分析，发现FELB起源于叶片的薄壁组织(图3D)，属于内起源发育方式。

A和B.FELB早期结构，示FELB细胞快速分裂区(FCDZ)，bar=250 μm； C.FELB发育中期(球形胚)，bar=500 μm； D.FELB发育后期(心形-鱼雷过渡胚)，bar=750 μm图3 烟草FELB结构不同发育阶段的冷冻切片

3 结论与讨论

在烟草FELB的诱导发生过程中，黑暗条件与2,4-D(10 mg/L)能够高频诱导出大量特殊的愈伤组织与FELB结构，而添加不同浓度NAA的培养基，以及光照条件下的所有2,4-D和NAA处理组均未能诱导出FELB结构。由此认为，合适的生长素类物质与浓度、避光是诱导烟草FELB成功的关键因素。并且，叶片的特殊愈伤组织与FELB产率最高，根次之，茎最少，这说明同一受体植物材料的不同外植体对相同诱导条件的反应不尽相同。在光照条件下，添加BAP(2.0 mg/L)的培养基可以高效地启动FELB再生成苗；但是，黑暗条件下，因缺失光的参与，致使无法启动烟草FELB胚体萌发的形态建成。这与之前研究龙葵、蔊菜FELB结构的胚体萌发诱导结果是一致的，合适的光照处理与一定浓度的细胞分裂素诱导是FELB胚体萌发成苗的关键因素[3,5]。

烟草FELB的发生发育和再生过程可以简单概述为：外植体—愈伤组织—FELB—成苗。在FELB的诱导发生过程中，笔者发现首先诱导出现的是特殊的愈伤组织，其排列比较疏松，细胞核较小，呈黏性和半透明状态。继而，在愈伤组织中逐步形成许多蛙卵状的胚状体。愈伤组织为胚状体的早期发育提供了水分、营养物质、植物生长调节剂等物质的共质体途径传递与供给，以及保护作用。特别是胚体发育后期，特殊愈伤组织的逐步减少，为胚体的进一步自我干燥、胚体萌发提供了良好的外周环境。FELB发生部位因其细胞的增殖速度以及新陈代谢旺盛，细胞核较大，染色体丰富，因此易被醋酸洋红染成浅色。而愈伤组织部分的细胞增殖速度慢，新陈代谢速率不旺盛，细胞核较小，因此会被伊文斯兰染成深色。笔者在鉴定区别龙葵[3]、蔊菜[5]等植物的FELB结构与非胚性组织，以及其他胚体结构如栝楼RTB[4]与非胚性组织等研究中，也得了印证。

研究发现，典型SE结构、兰科与蔷薇属PLB等体细胞胚结构与烟草FELB结构在诱导发生方法、发育流程、胚体萌发再生等方面均存在较大区别。比如，多数植物的SE结构无需培萌再生诱导，其发育后期可以直接形成萌发状态胚体；狗蔷薇(Rosa canina)的PLB[13]结构的发育流程为：蔷薇小叶—愈伤组织—类根体—PLB，并且单个PLB结构可以形成多个独立单胚，部分可进行自发胚萌，亦可离体诱导再生。在烟草FELB结构的诱导过程中，其诱导发生途径相对简单、易于分离和便于人为调控分析。特别是，烟草FELB的发生诱导与其再生诱导存在着明显的时空隔离，由两步法完成。因此认为，烟草FELB结构不同于经典SE、兰科和蔷薇属PLB结构，属于一种新型的体细胞胚发生结构。

烟草的转化和再生体系[21]虽然已建立，但因其无菌苗培养等步骤以及转化过程相对比较繁琐。利用烟草新型体细胞胚FELB可以快速、高效建立其遗传转化体系，并由此可以获得无菌、脱毒材料，为其他茄科植物的再生与转化等相关研究提供了研究思路。笔者前期研究发现，烟草FELB结构可以进行超低温保存，鉴于其发生诱导与再生诱导存在时空隔离，因此构建了基于FELB结构的烟草干细胞悬浮培养体系。由于FELB结构的诱导路径简单，应用前景广阔，所以深入研究烟草新型体细胞胚FELB结构的发生、优化其悬浮培养体系，对烟草干细胞生物反应器的实验室初试、中试模型的构建具有很高的理论价值和实践意义。