有机、无机肥配施比例对植烟土壤细菌组成及烤烟产质量的影响

刘 昌，黄 莺，陈 雪，喻奇伟，夏忠文，熊 晶，谢志勇

(1.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州省烟草品质重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 烟草学院，贵州 贵阳 550025； 4.贵州省毕节市烟草公司，贵州 毕节 551700)

烤烟生产中，因过于追求高产而大量使用化肥，不仅不利于烤烟内在化学品质的协调，而且导致了化肥资源的极大浪费并引发环境问题[1]，有机、无机肥配施的施肥方式很大程度上可以改变这一现象。有机、无机肥配施不仅提供了植物生长所需的养分，改善了土壤的理化性质，促进良好土壤团聚体的形成，而且提高了土壤微生物活性。陆地生态系统中的有机物主要由土壤微生物分解和转化。因此，土壤微生物与土壤肥力及土壤健康有着密切的关系[2]。细菌作为土壤微生物中丰富度最高、含量最多的类群，在土壤生态过程中有至关重要的作用[3]。细菌多样性的变化会对土壤生态过程如养分循环等造成影响[4-5]。因此,可将土壤细菌的群落结构作为反映土壤肥力状况的指标[6]。前人对植烟土壤微生物群落结构的影响研究多集中于不同种植模式和不同施肥管理措施等方面[7-11]，而在有机、无机肥配施比例方面的研究则较为有限，且大多采用的是培养法、DGGE(变性梯度凝胶电泳)、T-RFLP(末端限制性片段长度多态性)、FAME(脂肪酸甲酯谱图)和PLFA(磷脂脂肪酸)等传统方法，不仅工作量较大，而且获得的信息量少，局限性日益凸显[12-15]。特别是在贵州烟区，采用新一代测序方法的研究更为缺乏。由于作物、耕作环境、土壤类型以及土壤肥力等因素，有机肥替代无机肥的比例在不同生态区域有所差异[16]。为此，采用Illumina测序研究了有机、无机肥配施比例对土壤细菌组成的影响，以期为贵州烟区施用有机肥替代部分无机肥、实现减肥增效提供理论依据和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验地概况与材料

试验于2017年3—9月在贵州省毕节市黔西县林泉镇(105°48′～105°58′E、26°59′～27°05′N)毕节市烟草公司黔西林泉科技园内进行。该区域年均温度为13.8 ℃，最高温度为32 ℃，最低温度为2 ℃，年均降雨量为1 005 mm，日照时间为170 d，海拔为1 350 m。

供试土壤类型为黄泥土，含有机质26.88 g/kg、全氮1.45 g/kg、碱解氮127.35 mg/kg、有效磷5.68 mg/kg、速效钾169 mg/kg，pH值为7.29。

供试肥料：烟草专用复合肥(9-13-22)由贵州省毕节市烟草公司生产；有机肥为贵州省金沙县烟草公司生产的商用酒糟有机肥，含有机质 19.43%、N 2.16%、P2O51.37%、K2O 1.45%；磷肥为福辉牌过磷酸钙(含P2O5≥12%)；钾肥为罗布泊牌农业用硫酸钾(含K2O 51%)。

供试烤烟品种为云烟87。

1.2 试验设计

在施基肥时，设计有机氮取代无机氮处理，取代比例分别为0%、25%、50%、75%、100%，共5个处理，分别为T1、T2、T3、T4、T5,重复3次，小区面积为66.7 m2，采用随机区组排列。所有处理保证总施氮量相同，均为91.875 kg/hm2，其中基肥N∶P2O5∶K2O为9∶13∶22，提苗肥N∶P2O5∶K2O为15∶8∶7，追肥N∶P2O5∶K2O为13∶0∶26，基肥、提苗肥和追肥按5∶1∶4施入植烟土壤。不同处理中氮、磷、钾差异部分用尿素、过磷酸钙、硫酸钾补足，基肥在起垄打窝后施入，提苗肥与追肥水溶后施入。烤烟种植密度为17 990株/hm2，行距为1 m，株距为0.5 m，四周设保护行。育苗、田间管理按优质烟生产技术规范实施。

1.3 土壤样品的采集

在烤烟采收完毕后(2017年8月15日)进行土壤样品的采集。按照5点取样法分小区进行采样。采集时先除去地面植被和枯枝落叶，铲除1 cm左右的表土，再进行0～20 cm耕层土壤采集，混匀后采用四分法保留1 kg土壤样品装入已灭菌的牛皮纸袋中，立即放入4 ℃冰盒中保存。将冷藏土样带回实验室后，剔除植物残体、较大的土壤动物及石头等，再迅速过2 mm筛。然后在-78 ℃条件下保存，用于土壤细菌的16S rDNA 序列的测序分析。

1.4 土壤细菌的测序

土壤细菌16S rDNA 测序在上海美吉生物医药科技有限公司进行。按照第二代高通量测序技术要求进行基因组DNA的抽提、PCR扩增、产物纯化、定量、均一化、制备Miseq PE文库，最后采用Illumina公司的Miseq PE300测序平台进行高通量测序。土壤细菌16S rDNA 的PCR扩增引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

1.5 数据处理

采用Mothur软件对所获得的序列进行归类，按照97%的序列相似度分为多个操作分类单元(OTU)，参照文献[17-18]计算Alpha多样性指数。其他数据用SPSS 17.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 有机、无机肥配施比例对植烟土壤细菌组成的影响

2.1.1 土壤样品测序结果 对细菌16S rDNA的V3—V4区测序，5个处理共测得188 016条有效序列，平均每个样品的测序深度为37 603条。对各有效序列按照97%相似水平进行OTU聚类分析，在5个处理的土壤样品中，共得到2 236个OTU。图1为不同有机、无机肥配施比例下土壤细菌的物种venn图。由图1可知，T1—T5处理的土壤样本中检测到的OTU数目分别为1 797、1 895、1 13、1 713和1 905个。特有的OTU依次为75、26、12、22、29个，分别占T1、T2、T3、T4、T5处理土壤样本中总OUT数目的4.17%、1.37%、0.70%、1.28%、1.52%。其中，单施无机肥处理(T1)独有的OTU属于BRC1菌门，在施入有机肥的各处理中，均未检测到此类细菌的存在。可能是由于施入有机肥带入了新的菌种或物质，而导致此类菌种的灭绝或数量急剧减少到无法检出的水平。除T5处理外其余各处理均能检测到GAL15的存在，可能是因为较高浓度的有机肥施用不适合GAL15类细菌的生存。Parcubacteria菌门的细菌只存在于T2和T3处理中，Elusimicrobia菌门则只存在于T3处理中，说明施入有机肥会带入土壤中原本不存在或很少的菌种，且只能在一定的配施比例土壤中发展成为优势菌株。

每个椭圆代表1个样本; 2个椭圆重叠部分标注的数字N，指的是这2个样品均有序列被划分入相同的N个OTU 中图1 不同有机、无机肥配施处理土壤OTU分布

2.1.2 土壤细菌多样性 表1是不同处理土壤样本的Alpha多样性指数， Coverage指数代表了各样本的DNA文库覆盖度，由表1可知，各样本的覆盖度都在98%以上，能较为准确地反映样本的真实情况。土壤细菌样本的优化序列数目随施用有机肥比例的增加而增加。Sobs指数、Ace 指数和 Chao 指数属于丰富度指数，用于估计群落中含 OTU 数目的指数，群落物种的丰富度越高则其值越高[16]。T1处理与其余施用有机肥的4个处理相比，各丰富度指数都较低，表明单施无机肥土壤中的细菌种类少于施用有机肥的土壤。而在施用有机肥的各处理中，T4处理的Ace指数和Chao指数均最低，表明T4处理土壤样本的细菌种类可能最少。Shannon 指数是均匀度指数，用来估算样品中微生物的多样性，其数值越大，则群落多样性越高[19-20]。Shannon指数的变化情况与丰富度指数的变化情况类似，都是单施无机肥处理最低，施用有机肥的各处理较高，施用有机肥的各处理中，T2、T3处理的多样性较好，T4最低。

表1 不同有机、无机肥配施处理土壤细菌多样性分析

对测序序列进行随机抽样，对这些序列所能代表的OTU进行统计，然后以序列数与OTU数目构建稀释曲线，可以比较测序数据量不同的样本中细菌群落的丰富度，同时还能评判样本测序数据量是否合理。如图2所示，随着5个处理土壤样品测序数量增加，OTU数目呈先急剧上升后逐渐平稳的趋势，说明测序数据量合理[21]，更多的数据量只会产生少量新的 OTU，并且测序数据能覆盖样品中绝大多数细菌信息[22]，其细菌群落具有丰富的多样性。

图2 不同有机、无机肥配施处理土壤样本测序深度的稀释曲线

2.1.3 土壤细菌组成 5个处理的土壤样本主要分属29个门。对各处理菌门相对丰度均大于0.1%的菌门进行统计，得到16个菌门，约占总菌门数量的95.1%～97.11%。土壤中的第一大类群细菌为放线菌门(Actinobacteria)，在各土壤样品中均占细菌数量的25%以上。第二大类群为绿弯菌门(Chloroflexi)，在各处理土壤细菌中所占的比例也在22%以上。这2类菌占到了土壤细菌的一半以上。然后依次是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、蓝藻门(Cyanobacteria)、Saccharibacteria、装甲菌门(Armatimonadetes)、Latescibacteria、浮霉菌门(Planctomycetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、未知菌门(Unclassified_k_norank)、Tectomicrobia，其中包括0.31%～0.45%的未知菌门。图3为菌门相对丰度大于2%的各处理土壤样本菌门分布情况，可以看出，随着有机肥配施比例的改变，在土壤中占主导的菌群的相对丰度发生了改变。与T1处理相比，施有机肥的4个处理(T2、T3、T4、T5)土壤中的放线菌门和酸杆菌门相对丰度均有所下降，而绿弯菌门和变形菌门相对丰度均有所上升。而硝化螺旋菌门的相对丰度则随有机肥施用量的增加先增加后减少，并在有机氮施用比例为50%(T3)时达到峰值。蓝藻门则随有机肥施用量的增加，出现了持续增长的趋势。

图3 不同有机、无机肥配施处理土壤细菌菌门相对丰度

5个处理土壤样品的细菌主要分属于125目、245科。在属水平上对各有机、无机肥配施比例处理的土壤样本序列进行分析发现，5个处理土壤样本共得到429个菌属，其中丰度最高的norank-c-Acdiobacteria，占6.67%～12.74%，随后依次是嗜热光合菌属(Roseiflexus)、norank-c-Gaiellales、norank-c-TK10、norank-c-KD4-96等。但norank-c-Acdiobacteria在T1处理中的丰度明显高于施用有机肥的处理(T2、T3、T4、T5)。而嗜热光合菌属、norank-c-Gaiellales、norank-c-TK10和norank-c-KD4-96则在施用有机肥处理(T2、T3、T4、T5)中高于T1处理。在所测得的所有菌属中还包含6.05%～7.18%的未知菌属，这说明本试验采用的高通量测序技术克服了传统培养方法的不足，得到了更深层次的物种信息，可对不可培养微生物的新基因进行分析筛选，所测结果也更接近土壤微生物区系的真实情况[23]。距离热图(Heatmap)是根据物种或样本间丰度的相似性进行聚类，并将结果呈现在群落热图上，可使丰度不同的物种分块聚集，并通过颜色差别与相近程度来反映不同分组(或样本)在各分类水平上群落组成的差异性和相似性[19]。将这5个样品依据微生物丰度分布特征，从属水平上进行聚类，并将各处理排名前50的属呈现在距离热图上，各菌属的丰度用颜色的深浅程度来表示，颜色越深丰度越高，反之丰度越低。通过对各样本细菌科、属水平相对丰度进行聚类分析(图4)发现，T2与T5处理细菌在科、属水平上的结构组成相似度最高，与T3处理聚为一类后，再与T4处理聚为一类。而T1处理与其他处理细菌在科、属水平上的结构组成相似程度最低，最终与其他4个处理一起聚为一大类。说明施用有机肥的各处理间土壤细菌在科、属水平上的群落组成相似度较高，但与未使用有机肥处理的差异较大。根据图4中颜色梯度的差异可以看出，在土壤中施入有机肥会引起个别菌属丰度发生变化，其中，施用有机肥后土壤中的鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)、厌氧蝇菌科(Anaerolineaceae)相对丰度明显提高，而链霉菌属(Streptomyces)与小单胞菌科(Micromonosporaceae)则略有提高，并且在T3处理达到最高水平。

图4 不同有机、无机肥配施处理土壤细菌属水平相对丰度聚类分析

2.2 有机、无机肥配施比例对烟叶产质量的影响

由表2可知，5个施肥处理烤烟产量、产值、中上等烟比例和上等烟比例均无显著差异(P>0.05)。除T2处理产量、产值、中上等烟比例均稍低于T1处理外，其余施用有机肥处理均稍高于T1处理。施用有机肥处理上等烟比例均稍高于T1处理。综上，使用有机肥替代无机肥是可行的，总体上以T3和T4处理较优。

表2 有机、无机肥配施比例对烤烟经济性状的影响

3 结论与讨论

施肥是对土壤微生物环境稳定性造成人为干扰的最主要因素之一，肥料的施用量、种类都会对土壤微生物的多样性产生影响[2]。张平究等[24]发现，化肥配施有机肥改变了土壤细菌的组成。陆海飞等[25]也发现，有机肥与化肥配施后能显著增大土壤细菌的Shannon指数和丰度指数，长期有机、无机肥配施可显著提高土壤细菌的多样性。本研究发现，土壤细菌Ace指数、Chao指数和Shannon指数总体上均随有机肥施用比例增加先增加后降低，均比单施无机肥处理有所提高，但差异不明显。这可能是因为虽然有机、无机肥配施能提高土壤细菌的丰富度和多样性，但是土壤细菌的丰富度和多样性还可能受其他因素影响，也有可能是因为本研究只进行了1 a，时间较短，所以仅仅表现出有机、无机肥的配施能够增加土壤细菌多样性的趋势，差异不明显。此外，施入有机肥后会导致土壤中某些原位细菌数量减少，尤其是高施用量时，也可引入某些外来菌种，但由有机肥带入的外来菌种只能够在一定的配施比例下生存。

本研究还发现，有机、无机肥配施能对土壤细菌的组成产生一定的影响。在门水平上，占主导地位的放线菌门和酸杆菌门相对丰度有所下降，而绿弯菌门和变形菌门相对丰度有所上升，这与刘海等[12]的研究结果一致。而硝化螺旋菌门的相对丰度则随有机肥施用量的增加先增加后减少，并在有机氮施用比例为50%(T3)时达到峰值。土壤中的亚硝酸盐可以被硝化螺菌转化为硝酸盐，来满足植物的生长。这可能是有机、无机肥配施改善土壤微环境后的表现之一[26]，表明适当的有机肥与无机肥配施，可以优化土壤细菌的组成，促进部分有益微生物数量增加。施用有机肥也可以提高土壤蓝藻门含量，由于土壤蓝藻含有固氮酶，可直接进行生物固氮，还可以固碳、增氧以提高土壤肥力。

T2与T5处理细菌在科、属水平上的结构组成相似度最高，与T3处理聚为一类后，再与T4处理聚为一类。而T1处理与其他处理细菌在科、属水平上的结构组成相似程度最低，最终与其他4个处理一起聚为一大类。说明施用有机肥的各处理间土壤细菌在科属水平上的群落组成相似度较高，但与未使用有机肥处理的差异较大。根据图4中颜色梯度的差异可以看出，在土壤中施入有机肥会引起个别菌属相对丰度发生变化，其中，施用有机肥后土壤中的鞘脂单胞菌属、亚硝化单胞菌科、厌氧蝇菌科得到了显著的提高，而链霉菌属与小单胞菌科则略有提高，并且在T3处理达到最高水平。

在科、属水平上，施用有机肥后，鞘脂单胞菌属、亚硝化单胞菌科、厌氧蝇菌科、链霉菌属、小单胞菌科、假单胞菌属等丰度都有所提高，并在T3处理达到最大。鞘脂单细胞菌属可以促进烤烟根部对营养的吸收、增强对多种病原菌的抵抗力，并且是降解土壤有毒物质最有效的菌属之一，也有研究表明，某些鞘脂单细胞菌属的菌株具有固氮和脱氢功能，对维持烟田土壤氮素平衡有重要作用[27]。亚硝化单胞菌科参与了土壤中的亚硝化作用，能够加速有机氮的分解与转化，是决定土壤氮素循环的关键微生物。厌氧绳菌科作为绿弯菌门的代表类群，在猪粪厌氧消化的过程中起降解作用，在有机物分解方面有重要作用[17]。链霉菌可以产生抗生素类物质,能够特异性地抑制某些病原菌的生长和繁殖,从而降低病害的发生[28]。小单孢菌科也能够产生多种抗生素，同时可以分解一些不易分解的有机质，如木聚糖、几丁质、纤维素等。所以，施用有机肥后可以明显改善土壤中有益微生物的组成，更利于烤烟的生长。通过对比各处理间的差异，在有机氮取代无机氮比例小于50%的处理(T1、T2、T3)中，随着有机氮取代比例的增加土壤细菌丰度增加，土壤细菌组成得到改善，鞘脂单胞菌属、亚硝化单胞菌科、厌氧蝇菌科、链霉菌属、小单胞菌科等有益微生物丰度提高。但在有机氮取代比例高于50%时(T4、T5)，随有机氮取代比例增加，上述有益微生物丰度反而减小。所以在有机氮取代比例为50%时，可以最大限度地增加土壤有益细菌的丰度。

综合土壤细菌多样性、组成以及产值和中上等烟比例来看，有机氮的取代量为50%时的效果较好。单施无机肥处理与施用有机肥处理土壤细菌在科、属水平组成相似度上有较大差异。