重组产气荚膜梭菌ε毒素三点突变体的融合表达及其免疫活性分析

杜吉革，张秀坤，朱 真，薛 麒，李启红，印春生，彭小兵，王 磊，姚文生，康 凯，陈小云

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原，其主要致病因子是其分泌的外毒素，能引起人和动物发病[1]。其中，ETX是该菌所有外毒素中毒力最强的毒素，能够引起动物的坏死性肠炎或者肠毒血症，导致感染动物在很短的时间内死亡，从而使抗生素治疗失去意义[2]。为此，ETX的疫苗免疫是防制其所致疾病的主要手段。然而，传统ETX的类毒素疫苗仍存在一定的缺点和安全隐患[2]。因此，无毒的ETX，对于开发ETX基因工程亚单位疫苗，及以其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用显得尤为重要。

ETX主要是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，属于成孔毒素家族。已有的研究证实，组氨酸残基是影响ETX蛋白活性的关键性氨基酸，而第106位的组氨酸突变为脯氨酸的重组ETX基本是无毒的，然而该重组突变体的可溶性表达比例较低(小于5%)，不利于后续的大量生产和纯化[2]。此外，姚文武[3]研究发现，第196位氨基酸突变后能够明显降低ETX毒力。在亚单位疫苗的研制中，增加Th细胞表位和佐剂能够提高疫苗的免疫原性。已有的研究表明，口蹄疫病毒VP4蛋白的第20-35位氨基酸是一种良好的Th细胞表位[4]。作为一种应用较为广泛的免疫佐剂，细菌的鞭毛蛋白(flagellin)主要是通过其高度保守的N端和C端来激动TLR-5受体，从而诱发机体产生更强的体液免疫与细胞免疫应答[5]。本研究利用基因合成技术，在对ETX编码基因进行密码子优化的同时，引入了3个氨基酸位点突变：Y30A、Y196A以及H106Y，从而降低了因单个氨基酸突变在未来基因工程疫苗大规模生产中可能造成的生物安全隐患。……