体外辅助生殖用耗材产品环氧乙烷残留限量的风险探讨

许耘，田佳鑫，杨晓冬，邓洁

（国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心，北京，100081）

近年来，随着人类辅助生殖技术（ART）的不断成熟，辅助生殖技术用相关医疗器械产品也逐渐增多，出现了诸如穿刺取卵针、显微注射针、胚胎移植导管、培养皿等耗材类医疗产品。由于辅助生殖用医疗耗材的作用对象是配子、合子及不同细胞阶段的胚胎，这些细胞对微环境的变化十分敏感，ART过程中微小的环境因素都会对胚胎的生理学、遗传学产生影响。有研究表明，甲醛残留、葡萄糖含量、血清浓度等均有可能影响卵裂率[1]，影响DNA甲基化及基因印记过程，从而使子代出现印记异常并可能导致出生缺陷的发生[2]。这些因素对未来个体发育影响深远、作用难以磨灭。

正是因为胚胎细胞的敏感性和分化潜能，欧洲替代方法验证中心（the European Center for the Validation of AlternativeMethods, ECVAM）提出的胚胎干细胞试验（embryonic stem cell test, EST）作为体外筛选和评价受试物发育毒性的手段已为学术界普遍接受[3]。在EST的研究中发现，对受试物质毒性的评价和检测终点不应仅仅考虑细胞毒性，还应考虑胚胎毒性。原因在于有些受试物在低浓度时即可抑制干细胞分化, 具有较强的胚胎毒性；而其细胞毒性作用浓度（包括成纤维细胞和干细胞的细胞毒性作用浓度）却比胚胎毒性浓度高出很多个数量级[4]。

鉴于此，在对辅助生殖用耗材医疗产品进行生产设计和技术审评时，相关的生物学评价项目及评价标准以及生产工艺过程中各种化学物质的残留限量标准也应做进一步的验证。

本文综述环氧乙烷灭菌残留量对胚胎细胞的影响并探讨如何合理制定辅助生殖用耗材类医疗器械产品中环氧乙烷残留限量的要求。

1 环氧乙烷的毒理作用机制

环氧乙烷（ethylene oxide，EO）是一种化学性质活泼的杂环氧化物灭菌剂。环氧乙环在低温下为无色液体，沸点10.8℃，在常温下为无色气体，易燃、易爆、空气中浓度达3%以上，即有爆炸危险。环氧乙烷的杀菌原理是通过对微生物蛋白质分子的烷基化作用，干扰酶的正常代谢而使微生物死亡。其主要优点是穿透力强、杀菌谱广，对材料破坏力小。因此，环氧乙烷灭菌是医疗器械产品常用的低温灭菌方法。然而作为化学灭菌剂，环氧乙烷对于人体也是致癌和致畸化学物质。关于环氧乙烷的毒性及其在医疗器械产品中残留量的研究一直受到关注。

在动物致癌研究中，吸入环氧乙烷可导致包括白血病、脑肿瘤和乳腺肿瘤，而食入或皮下注射环氧乙烷会在接触部位形成肿瘤。1994年，国际癌症研究机构（IARC）依据环氧乙烷的作用机理，重新将其划分为人类致癌物质（一类）。此外，环氧乙烷还可与生产环境中的氯离子反应，生成2－氯乙醇（ECH），ECH具有轻微的致突变性，具有产生胎儿毒性和致畸性改变的潜能，并对肺、肾、中枢神经系统和心血管系统有损伤[5]。

环氧乙烷的毒理作用机制在于它具有很强的亲电子性, 易与核酸和蛋白质分子的亲核中心反应。环氧乙烷对DNA碱基的烷化作用被认为是其一系列基因毒性的分子基础。理论分析、离体模拟反应以及分离的体内烷化DNA分析结果都说明EO并非与DNA链上不同亲核中心随机发生烷化反应的，而是优先与DNA链上鸟嘌呤的N7位反应, 生成N 7-(2-羟乙基)-鸟嘌呤加合物，该加合物可占EO与离体DNA 反应产物总量的90 %。EO也会与蛋白质肽链上的亲核中心发生反应，反应可能发生在半胱氨酸的巯基，组氨酸咪唑环Nl位、N3 位氮原子以及肽链末端缬氨酸。EO-血红蛋白加合物的生成水平显著高于相应的DNA加合物生成水平[6]。

2 环氧乙烷对生殖细胞的影响

环氧乙烷对生殖细胞影响的研究起步很早, 研究对象从细菌、啮齿类、灵长类直至人类都有涉及,作用水平包括整体水平、组织器官水平、细胞染色体水平以及DNA、蛋白质等生物大分子水平。

中国科学院上海昆虫研究以黑腹果蝇为材料，检测吸入环氧乙烷对不同发育阶段的果蝇生殖细胞，包括成熟精子、精细胞和精母细胞的影响，结果显示环氧乙烷对果蝇生殖细胞具有一定的诱变作用[7]。

通过对雄性小鼠及大鼠吸入环氧乙烷试验显示，在亚慢性毒性试验中较低浓度EO暴露组均观察到精子活动率下降，提示精子能量代谢发育状况受影响，环氧乙烷各剂量组的精子畸形率均比空白对照组高，提示精子的正常生长发育受到干扰，严重的精子畸形可影响受孕能力[8-9]。

环氧乙烷是小分子的水溶性化合物（分子量为44），可以容易地通过血睾屏障而影响生殖细胞；许多研究已证明生殖细胞的DNA 和蛋白质在EO暴露后被烷化而形成有基因毒性的加合物，在哺乳动物生殖细胞中的显性致死突变及遗传性的易位都是EO引起的基因突变。这种突变也可能发生在基因表达的分化中，包括遗传信息转录和翻译后的后几个阶段。环氧乙烷可能作用于各级生精细胞膜或细胞内的蛋白质或其它活性物质中的巯基，进而影响生精细胞的结构和功能，造成生精细胞发育障碍和成熟过缓甚至抑制精子的发生[10]。

3 环氧乙烷的基因毒性

早在上世纪90年代Dellarco等报道了EO在哺乳动物测试系统中导致基因突变和染色体畸变[11]。陆静芬等通过小鼠吸入EO试验观察到EO使小鼠骨髓细胞分裂中的染色体畸变，主要为裂隙、断裂及断片, 且随着浓度的增加而加剧。并发现染色体断裂位置较多是在着丝粒区域，故推测着丝粒区可能是受EO影响的染色体敏感区域，并提出断裂、断片现象可作为一个敏感的遗传毒理学参数，作为测定受EO毒性影响的染色体损伤指标[12]。

Ames试验是一种常规的遗传毒性检测方法，由于其能检测DNA序列的突变，是评价化学物致癌性的重要手段。如图1所示将Ames试验用于筛选诱变剂：两种阳性诱变剂（左为敌克松，右为叠氮钠）在不加S9代谢活化系统的情况下，均可导致测试菌株的回变菌落数增多（注：无诱变剂时，仅见少量自发突变菌落），说明其具有致突变作用，并且可通过化合物所致回变菌落数的多少对其致突变作用的强弱进行初步判断，乃至用于致癌物的筛选。

图1 Ames试验用于筛选诱变剂。左：TA97菌株阳性诱变剂敌克松不加S9的菌落回变数；右：TA1535菌株阳性诱变剂叠氮钠不加S9的菌落回变数Fig. 1 Screening of mutagens using Ames test. Left∶ the revertant colonies of TA97 treated by Dexonin without S9; Right∶ the revertant colonies of TA1535 treated by SA without S9

张建军等发现培养皿中环氧乙烷的残留在活化和非活化两种条件下均能对Ames试验中TA100、TA1535菌株有致突变性，表现为TA100菌株的回变菌落数增多，约为自发回变数的1.5倍；TA1535菌株的回变菌落数增多，约为自发回变数的10倍。这表明EO作为直接的烷化剂，具有与DNA和蛋白质形成加合物的化学活性，体内外均可导致突变并引发多物种的致畸变作用[13]。对于医疗器械中环氧乙烷及2-氯乙醇残留量的限定，目前应用最广泛的标准为国际标准化组织（ISO）制定的ISO 10993-7，该标准等同转化为GB16886.7《医疗器械生物学评价•第7部分环氧乙烷灭菌残留量》。以单个培养皿质量约为16 g计，EO残留量约为160μg，以单个培养皿面积约为64cm2计，EO残留量约为640 μg，表明较低剂量下仍具有很强的致突变能力。

发育毒性是指出生前后接触外源性理化因素引起的在子代的寿命期内出现的任何对发育有害的表现。能造成发育毒性的物质称为发育毒物。出生前的发育毒物应是在未诱发母体毒性的剂量下产生发育毒性的物质[14]。在着床前期接触毒物造成胎儿畸形的例子包括环氧乙烷、甲基亚硝脲等。着床前期又分为受精、卵裂、囊胚形成，这些过程也正好是体外辅助生殖技术关键作用时期。

4 体外辅助生殖用耗材产品EO残留的风险及控制措施

对于人类体外辅助生殖用耗材类产品的生物相容性评价，目前除了参考GB/T16886系列标准进行相关的评价之外，一般还应进行体外鼠胚试验和人精子存活试验。然而，对胚胎毒性的评价并不能以细胞毒性的结果为依据，因为受试物对胚胎细胞的影响并不仅仅体现在细胞毒性，还体现在细胞分化等各个阶段的改变，也就是说，受试物产生胚胎毒性和细胞毒性的剂量是有差别的。有些受试物在抑制胚胎细胞分化和造成胚胎细胞毒性的浓度并不同，因此除了对细胞毒性评估之外，通过受试物对胚胎细胞的早期阶段到最终分化成特定细胞的全过程的检测，可以对受试物是否具有胚胎毒性做出正确的判断。

相关生产企业、使用单位及监督检查部门都应该对环氧乙烷在体外辅助生殖用产品的特殊影响提高防范意识。此类产品最好不采用环氧乙烷灭菌。若为环氧乙烷灭菌，应严格规定纸塑包装、环氧乙烷限量及解析时间，并对解析时间进行验证。送检样品应能代表批量产品的解析条件，其检验结果应能反映出批量产品中的残留量。建议将相关信息明确在产品标签上。

生产企业在产品放行时应考虑到EO 残留量，建议对一年中不同时期的通风、温度等条件的变化进行数据采集和分析，绘制扩散曲线，根据扩散曲线数据进行放行。

5 总结

环氧乙烷的残留对体外辅助生殖用相关医疗产品的影响比其他医疗器械更为复杂，这不仅仅体现在该类器械对所接触细胞的细胞毒性，还体现在胚胎细胞分化各个阶段的改变。因此，对于体外辅助生殖用医疗产品中环氧乙烷残留的风险分析及控制措施应更加审慎。