中医药与脑缺血后海马神经干细胞增殖与分化

黄生辉 ，巩婷，李妍怡*

(1甘肃中医药大学中西医结合学院，2 甘肃中医药大学附属医院神经内科，3甘肃省中医院脑病科，4甘肃中医药大学中西医结合研究所，兰州 730000)

缺血性脑血管疾病是一种高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的疾病，严重的影响着人类的健康和生存质量，其高治疗成本也给家庭和社会带来了沉重的负担[1]。脑缺血后，脑功能的最终恢复需要通过神经和血管再生。然而，人体自身的修复和再生的能力不足造成了脑缺血性损伤及由此导致的残疾或死亡。已有大量研究证实：单味中药、中药有效成分、中药提取物、中医复方对海马神经干细胞具有调控作用，可以促进缺血性脑血管疾病神经发生与损伤修复[2]。因此，中医药促进内源性神经再生与修复，是治疗缺血性脑血管疾病一个有希望的治疗策略。神经干细胞的增殖、分化调控是神经再生的主要机制之一，本文对中医药对海马神经干细胞在缺血性脑血管疾病方面的相关研究进行总结，综述与中医药促进海马神经干细胞增殖与分化相关的Notch信号通路、Wnt信号通路的机制研究，以期为中医药促进海马神经干细胞的增殖、分化研究提供理论依据与参考。

1 概述

神经干细胞 (neural stem cells，NSCs)是一类中枢神经系统内具有高度增殖、自我更新及分化能力，在一定条件下能够不断进行有丝分裂，并分化形成神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的原始母细胞[3]。神经发生(neurogenesis)是指神经干细胞增殖，并经历均衡和不均衡性分裂成为定向祖细胞，然后逐渐向功能区域迁移、不断发生可塑性变化并与其他神经元建立突触联系，从而产生神经功能的完整过程[4]。内源性神经干细胞主要存在于海马齿状回颗粒下层 (subgranular zone，SGZ) 和侧脑室下区 (subventricular zone，SVZ)，这两个神经再生活跃区域允许和支持神经发生[5]。既往研究表明，在脑缺血后，脑内的海马神经干细胞可被激活，并在多种细胞因子、基因的调控下发生增殖、迁移、凋亡和分化等。海马神经干细胞再生的多步骤过程受到内在的和或外在的不同因子调节，其调节有正面或负面影响，或两种影响兼而有之[6]。中医药如何在缺血性脑卒中后更好地促进NSCs的增殖与分化，使其向有利于机体神经功能恢复的方向发展，是缺血性脑卒中研究与临床治疗的一个新思路。因此，阐明NSCs增殖、分化的相关机制，寻找中医药调控NSCs增殖、分化的信号通路与靶标，具有重要的意义。

2 中药对脑缺血海马神经干细胞的影响

中药及其有效成分可以促进脑缺血海马神经干细胞的增殖与分化，促进神经再生[7]。在促进海马神经干细胞增殖、分化的中药中，主要分为益气、活血、补肾、滋阴、清热解毒等五类，研究方法可分为在体研究和体外研究[8]，在体研究多采用大脑中动脉线栓法脑缺血再灌注法造模，体外研究多采用缺氧复氧模拟脑缺血再灌注造模。中药能通过信号通路调整海马神经干细胞的增殖与分化，也可以通过促进生长因子 EGF， bFGF 等的表达，改善神经元损伤后的血液循环，减轻继发性损伤及抑制损伤神经元的凋亡等而有助于神经再生。

2.1 在体研究

大鼠灌胃给予山茱萸环烯醚萜苷后，应用免疫组织荧光法观察大鼠海马齿状回 Brdu 标记的神经干细胞，及免疫组织荧光双标染色法检测Brdu/Map-2 标记的新生神经元，发现山茱萸环烯醚萜苷对成年大鼠海马齿状回内源性神经干细胞的增殖及分化具有促进作用[9]。灯盏乙素，是从中草药灯盏细辛中提取的一种黄酮类化合物，在缺氧小鼠模型的研究中，灯盏乙素可以促进细胞增殖和神经干细胞向神经元分化[10]。丹酚酸 B 鼻腔给药可以增加脑缺血损伤大鼠海马区新生神经细胞数目，促进海马区神经细胞增殖，而且对新生神经细胞有保护作用[11]。人参皂甙具有显著的神经保护和神经营养作用，能促进神经干/祖细胞增殖，并促进轴突生长和神经元网络的形成[12]。芳姜黄酮是中药姜黄的主要活性化合物，可以抑制小胶质细胞的激活，其在体外和体内的研究数据表明，芳姜黄酮还可以诱导NSC增殖[13]。姜黄素可促进神经干细胞增殖，抑制其凋亡，其机制可能与激活 PI3K/AKT 信号通路有关[14]。黄芩苷能促进全脑缺血大鼠海马 NSCs的增殖，其机制可能与上调全脑缺血后海马脑源性生长因子蛋白的表达有关[15]。王海军的研究提示[16]：黄芩苷可能是通过降低COX-2基因表达、抑制损伤伴随炎症反应，从而改善内源神经干细胞小生境，促进内源性神经干细胞的增殖或存活率。银杏内酯B能提高缺氧缺血性脑损伤新生鼠神经干细胞增殖、分化的能力，提示其可以促进神经发生[17]。姜晓锋[18]等研究提示：大鼠脑梗死可以引起大鼠海马区齿状回的颗粒下层自体神经干细胞的增殖，三七三醇皂苷治疗可促进大鼠脑梗死后海马区齿状回的颗粒下层自体神经干细胞的增殖。 魏楚蓉等的研究提示[19]：三七总皂苷能增强海马神经干细胞的活性并能促进海马神经干细胞分化。张建平等的研究证实[20]：黄芪甲苷和三七总皂苷配伍对脑缺血再灌注损伤大鼠海马NSCs 的具有保护作用，主要是通过提高 OGD-R新生大鼠海马 NSCs 的存活率，抑制 NSCs 凋亡，促进NSCs增殖。

2.2 体外研究

益气活血药物人参和川芎含药血清可能通过ERK 信号通路促进氧糖剥夺复氧后大鼠神经干细胞的增殖，提高细胞活力，效果优于单用益气药物血清人参和活血药物川芎血清[21]。远志皂苷可以促进海马神经干细胞的增殖与分化[22,23]。张建平等采取无血清法培养新生大鼠海马NSCs，通过氧糖剥夺和再灌注体外模拟建立了脑缺血再灌注损伤模型，发现丹酚酸B可提高细胞的OD值、细胞存活率，抑制细胞的LDH漏出率和凋亡，促进细胞Nestin/BrdU表达，起到促进增殖的作用[24]。李社芳等的研究也提示：丹酚酸B可促进氧糖剥夺损伤大鼠海马神经干细胞的增殖，抑制其凋亡，还可诱导其向神经元分化[25]。人参皂苷可促进缺血再灌注后HIF-1α蛋白和VEGF蛋白含量进一步增加，通过促进神经干细胞的增殖与分化而促进脑损伤结构和功能的修复[26]。孙建忠等将人参皂苷 Rg1与大鼠神经干细胞进行共培养，结果显示人参皂苷 Rg1能显著增加神经干细胞的增殖率，促进移植神经干细胞内脑源性神经营养因子的表达而降低转化生长因子β的表达，表明人参皂苷Rg1 对大鼠神经干细胞具有一定的促进增殖作用[27]。冬虫夏草药物血清可体外诱导神经干细胞向神经元方向分化，并且在一定范围内存在量效依赖关系[28]。

3 中药复方及针灸对脑缺血海马神经干细胞的影响

3.1 中药复方体外研究

益气活血化痰中药复方(黄芪、川芎、三七、蜈蚣、陈皮、半夏、茯苓等) 药物血清有促进NSCs分化、增殖的作用[29]。当归芍药散的醇提部位( 浓度为50μg/mL，100μg/mL) 、二氯甲烷部位(浓度为100μg/mL) 对体外培养的神经干细胞有明显的增殖作用[30]。益肾活血方（“地黄饮子”化裁而成）含药血清可促进低糖低氧脑损伤 NSCs 的增殖[31]。益气养阴活血药物（人参、玉竹、川芎组合）可促进脑缺血再灌注后高糖培养大鼠神经干细胞的增殖，提高细胞活力[32]。

3.2 中药复方在体研究

补阳还五汤能够促进去势脑缺血雌性大鼠缺血侧海马 DG 区神经干细胞增殖，促进内源性神经再生，而激活 ERK/CREB 信号通路可能是其作用机制之一[33]。养血清脑颗粒能促进缺血再灌注脑损伤大鼠神经功能恢复，减轻脑梗死体积，并且对脑缺血再灌注损伤后神经干细胞增殖分化有促进作用[34]。醒脑通络片可使细胞Nestin 阳性增加，提示醒脑通络片促进局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损改善可能与其促进 NSCs 增殖与分化有关[35]。圣愈汤通过腹腔注射治疗创伤性脑损伤大鼠模型后，结果显示大鼠神经功能有所恢复，海马区 BrdU/NeuN免疫双标阳性细胞数增多，提示圣愈汤可以促进海马区 NSCs的增殖[36]。健脾益智胶囊可促进BDNF、EGF、bFGF阳性细胞数量增加，提示健脾益智胶囊能可能通过诱导BDNF、EGF、bFGF以促进缺血后神经干细胞增殖分化[37]。芪仙通络方可促进脑缺血大鼠内源性神经干细胞再生，在恢复期和后遗症期较明显，其作用机制可能与早期活化星形胶质细胞及上调BDNF的表达有关[38]。

在中医不同治法对脑缺血后海马干细胞的研究方面，也进行了积极的探讨。芪棱汤能够促进nestin、5-BrdU、GFAP表达，其可能通过刺激内源性神经干细胞增殖分化以弥补脑缺血再灌注后神经元的损失、修复缺损的神经组织、恢复丧失的神经功能，且益气养阴活血法优于益气活血法[39]。 总之，中药复方、中医治法及中成药对脑缺血后促进NSCs增殖分化有影响，但缺乏对其有效成分的深入探讨，而且对其作用的时效、量效关系及其确切机制均有待进一步研究。

3.3 针灸研究

针刺治疗充分体现中医治疗多靶点、多效应的特点，可促进海马神经干细胞的增殖和分化，促进机体内源性的修复能力。缺血缺氧能引起MCAO大鼠脑神经干细胞的增殖，而针刺人中穴能增强神经干细胞增殖作用，促进大脑功能的修复[40]。电针与口服天麻多糖结合治疗可显著增加脑缺血大鼠缺血侧海马CA3区巢蛋白和脑源性神经生长因子的表达，促进内源性神经干细胞激活，且作用效果优于分别使用电针或天麻多糖治疗[41]。电针治疗可促进脑梗死后神经缺损功能恢复，其机制可能与电针促进脑梗死大鼠海马区内源性神经干细胞增殖与分化，抑制内源性NSCs 过度分化为星形胶质细胞，及早长时程促进内源性NSCs 分化为神经元等机制密切相关[42]。也有研究提示：电针可以有效促进对脾虚证大鼠海马区神经干细胞的增殖，并促进细胞向神经元方向进行分化[43]。 电针研究提示：也可通过活化Notch信号通路，同时促进VEGF的分泌，促进海马神经干细胞的增殖，来实现对脑缺血的治疗作用[44]。艾灸能显著促进脑缺血再灌注后大鼠神经功能的恢复以及Brdu、Nestin 阳性细胞的增殖[45]。上述研究表明，针灸能够促进脑缺血海马神经干细胞增殖与分化，其发挥作用的具体机理研究及如何与现代治疗方法相结合将是今后研究的一个重要内容。

4 中药通过Notch通路和/或Wnt信号通路影响脑缺血海马神经干细胞

4.1 中药通过Notch信号通路影响神经干细胞

既往的研究已经表明，Notch信号通路和/或Wnt信号通路可以调控神经干细胞增殖、分化和神经发生[46]。Notch信号通路靶基因bHLH基因家族主要由Hes1、Hes3和Hes5等抑制型基因及 Math、Mash1/Hash1、Ngn等促进型基因构成，两类基因相互促进，共同调节神经干细胞的分化。目前普遍的认识是当Notch通路激活时，通路的下游靶基因Hes表达上升，促进 NSCs 向星型胶质细胞的分化，抑制NSCs 分化为神经元和少突胶质细胞[47]，从而促进NSCs的增殖，维持神经干细胞的多能性和自我更新能力。当Notch通路被抑制时，干细胞则进入分化程序。即阻断 Notch 细胞信号通路后，促进了NSCs向神经元的分化。

程建华等观察发现姜黄素可增加 NICD 的表达，并伴随 BrdU/NeuN 阳性细胞数的增多，其作用机制可能是通过激活 Notch 信号通路实现的[48]。蛇床子素具有明显促进神经干细胞增殖能力的作用，可通过引起Notch1基因、Hes1基因上调表达，对体外培养的神经干细胞起到促进增殖的作用[49]。补阳还五汤通过上调 Cav1/ Notch1/Hes1通路活性来促进缺血海马NSCs增殖，修复受损的神经功能[50]。补阳还五汤含药血清能明显上调缺氧NSCs Notch1、Hes1、Ngn1 mRNA以及下调 DLL1 mRNA的表达，促进其增殖；推测调节NSCs的 Notch信号通路相关因子mRNA表达水平可能是补阳还五汤促进脑缺氧损伤后神经再生的机制[51]。健脾益智胶囊可促进BrdU阳性细胞数量增加，提高Notch1、 Jagged1蛋白及基因的表达，提示其能可能通过激活Notch通路促进了缺血后神经干细胞增殖与分化[52]。脑泰方提取物能够促进MCAO模型大鼠缺血再灌注后神经细胞再生，其作用机制可能与Notch信号通路有关[53]。无论体内实验或者体外实验均表明在缺血性脑卒中发生后Notch 信号通路的激活可促进神经再生。至于Notch不同的配体与受体在成年神经再生过程中是否发挥相似的作用，Notch信号通路调控神经再生是否与细胞类型及细胞微环境有关等问题都有待进一步研究。

4.2 中药通过Wnt信号通路影响神经干细胞

Wnt信号通路是广泛存在于真核生物中的一条高度保守的信号通路，在脑卒中后神经干细胞的增殖、分化中扮演了重要的角色[54]，其能够调整细胞周期，促进细胞分裂，参与调控不同发育阶段 NSCs数量，神经细胞亚群以及终末神经细胞的产生[55]。脑缺血再灌注损伤可激发内源性 NSCs 的增殖，当Wnt/β-catenin 通路被激活时，Wnt1、Wnt3a 在海马齿状回颗粒细胞下层的阳性细胞表达增加[56]。已有许多研究表明 Wnt 信号能够显著有效促进成体NSCs 向神经元的分化。蛇床子素增强NSCs的增殖和分化，抑制细胞凋亡，作用机制可能是通过激活Wnt/β-catenin信号来实现的[57]。大鼠脑缺血再灌注后，毛冬青甲素可以通过激活经典Wnt信号通路促进神经细胞增殖和再生[58]。丹龙醒脑方能改善神经缺损症状，促进脑缺血后海马区 NSCs 增殖，其机制可能与上调缺血再灌注后海马区 Frizzled1、Dvl1表达，促进下游靶基因 CyclinD1 的表达水平有关[59]。邓勇等研究发现：体现益气活血通络法代表方脑络欣通对气虚血瘀型中脑动脉阻塞再灌注模型大鼠神经损伤具有保护作用，机制可能是通过上调Wnt3a、Wnt5a以及β-Catenin的表达调节脑缺血后神经干细胞的增殖分化[60]。

最近的研究发现，Wnt信号在不同时期，其作用有所不同。在发育的大脑皮质中稳定表达的β-catenin引起早期神经干细胞的过度增殖,而在后期则使细胞周期停滞并促进分化，并且，这种时期特异性在体外的动物实验中也得到了验证。目前，中药及中药复方通过Wnt信号通路对神经干细胞的影响主要集中在调控经典 Wnt 通路，而对非经典 Wnt 通路的研究较少。中药的多组分特点决定了其对NSCs的调控具有多靶点、多途径、多效果的优势，而信号通路之间的“串话”，是中药发挥其诱导神经干细胞的重要途径。也有研究提示，Notch 信号通路的激活可以通过降低β-catenin 积累而抑制 Wnt 通路，Wnt 通路的激活也可以抑制 Notch 通路的活性[61]。总之，以Notch和Wnt信号通路为代表的干细胞信号通路与神经再生密切相关，既相互制约又可相互促进，通路之间存在直接和间接的关系，而Notch与Wnt信号通路如何协同调控神经再生尚未完全阐明，Notch信号通路、Wnt信号通路与其他信号通路之间协同调控神经干细胞的分子、蛋白机制也将是以后研究的一个重要方向。寻找促进神经干细胞增殖与分化的有效中药是加速神经干细胞临床应用的重要途径之一，本课题组正在进行中医药协同调控神经干细胞增殖与分化作用相关的实验探讨，结果将在后续的文章中报道。综上所述，现将中药有效成分及中药复方调控脑缺血海马神经干细胞增殖分化信号通路及靶点总结见表1。

表 1 中药有效成分及中药复方调控脑缺血海马神经干细胞增殖分化信号通路及靶点Tab.1 The active components in Chinese single and compound medicine that are involved in the signaling pathways and targets which regulate the proliferation and differentiation of hippocampal neural stem cells after cerebral ischemia

5 问题与展望

缺血性脑卒中给患者、社会带来了沉重的负担，而脑缺血后神经再生研究，可以促进患者功能的恢复，寻找促进神经再生的方法，可能是治疗缺血性脑卒中的有效途径。中药对体内外多种干细胞的增殖、分化等生理活动有促进作用[62]，以中药为重要手段的中医药疗法为脑缺血后内源性神经再生的研究提供了新的思路。但在目前的研究中，也存在众多待解决的问题与难点，如：海马神经干细胞的体外原代细胞研究中，直接将中药制剂加入细胞培养的体系，易于受到制剂的杂质、酸碱度、渗透压、电解质等因素影响，而采用血清药理学方法制备的含药血清进行干细胞实验，比传统直接加药方法更符合中药在体内代谢的实际情况[63]，能够更准确、更科学地阐明中医复方的药效及作用，是目前学者大多采用的研究方法，但对于 NSCs 遇血清后易分化的问题，有待研究者们进一步努力探索和解决。另外，对于脑缺血再灌后注海马神经干细胞的在体实验方面，脑缺血后可以激活自体海马神经干细胞的增殖、存活、迁移及分化，但增殖的数量有限,并且调节存活、迁移、分化以及神经元修复和突触形成的作用机制尚未完全阐明。中药如何选择合适的配伍，提高中药对血脑屏障的透过率；中药如何增加内源性神经再生；中药如何诱导缺血区干细胞向神经元定向分化并在神经组织内整合；中药如何避免体内抑制神经再生的因素；中药如何防止新生神经元的凋亡；中医复方促进干细胞增殖的有效成分探讨等都是有待进一步研究的方向之一。

NSCs的增殖、分化受到复杂的多条信号通路调节，各通路之间相互联系，共同构成了一个影响神经再生的网络信号调控系统[64]。因此，我们需要借助基因芯片、蛋白质组学、生物信息学等现代技术，在初步阐明单一信号通路机制的基础上，深入探讨通路之间的相互联系，如Notch信号通路和Wnt信号通路之间的“串话”等，逐步揭示中医药的多靶点、多环节、多层次的综合调控作用，从而阐明中药的物质基础和确切作用机制。相信，随着中医药在干细胞领域研究的不断深入，必将会为人类健康做出更大的贡献。