周末组织处理程序的改进

王玉环，方庆全

（厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003）

很多医院病理科周末切取的组织采用延时启动脱水程序进行处理[1]。我们通过实践发现这样组织切片易碎、易脱片，即使使用了防脱载玻片，效果也不理想，并且对后续HE染色、免疫组织化学检测、分子病理学检测等工作都造成了影响。作者对周末组织处理程序进行了改进，收到较好的效果。

材料与方法

1 材料

收集厦门大学附属第一医院病理科2017年10月至2017年12月的乳腺癌根治术标本40例，患者年龄24～70岁，平均年龄（41.1±8.7）岁。每例连续切取3块组织，取材大小均为 1.5cm×1.5cm，厚0.3cm，随机分为日常程序处理组（常规组）、延时程序处理组（延时组）和改进程序处理组（改进组）3组。

2 主要设备与试剂

Leica Peloris脱水机（德国莱卡）；梯度酒精、二甲苯、石蜡。

3 组织的处理程序

3组组织分别按表1的处理程序进行固定、脱水、透明、浸蜡，按常规进行切片、HE染色[2]、免疫组织化学检测[3]、荧光原位杂交实验（fluorescence in situ hybridization，FISH）[4]。

表1 组织处理程序Tab.1 Tissue processing procedure

4 统计学分析

采用SPSS 22.0 进行统计学分析，计数资料率的比较采用χ2检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 改良法不影响切片肉眼可见裂痕或脱片发生率

切片肉眼可见裂痕或脱片的发生率在常规组为 2.50%（1/40），延时组为37.50 %（15/40），改良组为5.00 %（2/40）。常规组与延时组比较，差异有统计学意义（χ2=15.31，P＜0.01）；常规组与改良组比较，差异无统计学意义（χ2=0.35，P＞0.05）。

2 改良法不影响HE切片染色质量

常规组切片细胞核与细胞质对比清晰，红蓝适度；延时组切片红（细胞质）与蓝（细胞核）对比稍不清晰，组织结构稍模糊；改良组切片细胞核与细胞质对比清晰，红蓝适度，染色质量与常规组相近（图1）。

3 改良法不影响免疫组织化学检测质量

3组切片免疫组织化学检测阳性率相同。但显色质量有所差异，常规组切片染色强度强、阳性定位准确、着色均匀、背景清晰、无非特异染色；延时组切片染色强度较弱、阳性定位准确、着色均匀、背景欠清晰；改良组切片显色质量接近常规组（图2）。

4 改良法不影响荧光原位杂交效果

常规组切片橙色荧光呈蔟状扩增，延时组切片无扩增，改良组切片橙色荧光呈点状扩增（图3）。阳性常规组和改良组切片荧光原位杂交实验结果阳性率均为37.50%（15/40），差异无统计学意义；延时组阳性率为17.50 %（7/40），与常规组或改良组比较，差异均有统计学意义。

讨 论

活体组织一旦停止血液循环和物质代谢就会因物质代谢障碍产生一系列的生物化学和组织化学改变，必须尽快进行固定，固定的作用是尽量保持细胞、组织的固有形态和结构。组织经固定后，含有大量水分。组织在透明浸蜡前必须进行脱水，就是用某些溶剂将组织内的水分逐渐置换出来，以利于透明剂和石蜡的渗入。病理技术工作者要想制做出优良的切片，组织脱水是重要的环节。如何设计出一套适合本科室实用的脱水程序是制片好坏的关键所在。我们科根据Leica Peloris脱水机工程师的建议，查阅参考大量文献，总结工作经验，设置了上述常规组处理程序用于日常组织处理，沿用至今，脱水效果好且稳定。遇到周末等节假日，使用延迟启动脱水程序时，直接将标本长时间固定于10%中性福尔马林里。这样的组织处理效果不佳，特别是对后续的FISH等分子检测影响尤为明显。10%中性福尔马林是由甲醛液：0.01mol/L PBS = 1∶9的比例配制而成。甲醛固定组织的主要作用机制是在蛋白质末端基团之间形成交联链[5]，甲醛与组织蛋白形成桥键，时间越长，交联越复杂越紧密，导致后续免疫组织化学染色抗原修复难以修复完全，组织表达阳性减弱，甚至出现假阴性。核酸的碱基也涉及到上述过程中，甲醛固定组织会导致基因组 DNA断裂，甲醛与蛋白质的广泛交联阻碍核酸的定量分析并局限了 DNA 片段的 PCR 扩增产物的长度[6-8]。固定时间越长，这种交联会越严重，所以长时间的甲醛固定可在一定程度上影响高质量 DNA 和（或）RNA 的提取效率[9]。此外甲醛也是分子量最小的含氧有机物，具有较高的反应活性，甲醛介导的DNA损伤在固定3h后就明显发生，固定时间越长，甲醛所致的DNA损伤越严重，越不易从中获得大片段DNA，甲醛固定标本的DNA易降解成不同长度的片段，也不利于模板DNA进行PCR扩增反应[10,11]，这些都会影响FISH等分子检测结果，导致假阴性。

图1 HE染色效果比较。A，常规组；B，延时组；C，改良组；比例尺，100μmFig. 1 Comparison of HE staining results. A, regular group; B, delay group; C, improved group; scale bar, 100μm

综上所述，遇到双休日或者国家法定长假休息日，由于工作安排需要，取材的组织将预约处理。若长时间固定于中性福尔马林中，组织易脆裂，制片困难，对抗原和基因保存不利。若对程序进行优化，10%中性福尔马林的固定时间、二甲苯透明时间、石蜡浸蜡时间与日常处理程序相同，将多余的时间分配给各级梯度乙醇进行脱水，这样不但不会引起组织发脆、细胞收缩，反而使组织脱水更彻底，更有利石蜡的渗透，有利于后期制片，特别是有利于后期的HE染色、免疫组织化学检测或分子病理学检测。

图2 免疫组织化学染色结果比较。A，常规组；B，延时组；C，改良组；比例尺，50μmFig. 2 Comparison of immunohistochemical staining results. A, regular group; B, delay group; C, improved group; scale bar, 50μm

图3 荧光原位杂交检测乳腺癌中基因扩增效果比较。A，常规组；B，延时组；C，改良组；比例尺，10μmFig. 3 Comparison of gene amplification in breast cancer detected by fluorescence in situ hybridization. A, regular group; B, delay group; C, improved group; scale bar, 10μm