ATP酶组织化学染色孵育方法比较

宋艳，宋美仪，关伟明

(中山大学附属第一医院病理学教研室，广州 510080)

在肌纤维形态学分型研究和肌肉疾病病理诊断上，采用新鲜肌肉标本进行经典ATP酶组织化学染色非常重要。ATP酶组织化学主要原理是钙激活法[1]，当新鲜肌肉组织中的三磷酸腺苷酶被三磷酸腺苷水解为二磷酸腺苷和磷酸时候磷酸与钙离子结合，在酶活性处形成无色的磷酸钙，磷酸钙经氯化钴处理，形成磷酸钴，再经硫化铵处理便形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位。采用新鲜肌肉组织做相关病理学检查，因为组织本身时效要求严格，但是在肌肉各种特殊染色实验操作中的步骤繁复且需时较长，所以实验者们一直在临床运用中不断的改进和完善。如何在简化或者改进步骤的同时，保证染色结果的稳定有效性是基本条件。现收集我院2017年送到我科做肌肉活检的病例，比对不同孵育方法下染色结果总结各种方法的优缺点。

材料和方法

1 取材与冷冻切片

由本院临床科室取新鲜肌肉组织，注意取其横断面，直径约5～7mm，不加任何固定液，用生理盐水浸过的纱布包好，切忌不能在室温下过夜，送检病理科。把盛有异戊烷的50ml离心管置于液氮中，见有白色凝结物时镊子夹住肌肉组织放入冷冻约30s。然后装入冻存管中置液氮中保存或马上放进-25℃冷冻切片机切片。切片厚度为6～8μm。

2 主要试剂的配制

Tris-钙缓冲液：Tris（Hydroxymethyl）methylamine 3.025g；氯化钙0.499g；去离子水加至250ml；现配现用。酸性前孵育液：（pH4.35）乙酸钠0.2mol/L 9ml，乙酸0.2mol/ L 21ml，调pH至4.35，碱性前孵育液：Tris-钙缓冲液30ml，以0.1mol/L HCl仔细调至pH 10.4；ATP酶孵育液：a滴染法，ATP（disodium salt）45mg；Tris-钙缓冲液30mL；b浸染法，ATP（disodium salt）90 mg；Tris-钙缓冲液 60ml，0.1mol/L HCl调至 pH 9.5。ATP（disodium salt），异戊烷（isopentane）购自Sigma，其他化学试剂均为其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 ATP酶染色方法

ATP酶染色采Padykula和Herman法，37℃（pH9.4）孵育30min，硫化钴黑色沉淀为阳性反应，I型纤维呈浅染反应，Ⅱ型纤维呈深染反应[2]。已切好冰冻切片不用固定，在室温（25℃左右）下干燥30min，滴染法的玻片用免疫组化笔在玻片组织周围画圈（前孵育结束后），浸染法不用。分组：滴染法分为37℃孵育120～180min和4℃冰箱过夜。浸染法也分为37℃孵育120～180min和4℃冰箱过夜。将已干燥的玻片分别放入酸、碱性前孵育液30mL浸染缸，室温（25℃）下孵育30～60min，过双蒸水两遍。a滴染法：滴入ATP酶孵育液适量（多少由组织本身大小决定），37℃孵育120～180min和4℃冰箱孵育过夜；b浸染法：浸入ATP染色缸（提前37℃恒温箱预热）120～180min和4℃冰箱孵育过夜。1%氯化钙作用两次，第一次快速漂洗一遍，第二次作用3min。置2%硝酸钴反应3min。自来水快洗，再用去离子水洗2次。1%多硫化铵显色（现配现用），酸性前孵育液处理的切片反应约5min，碱性前孵育液处理的切片反应约3min。自来水充分冲洗，过去离子水，常规脱水封片。

结 果

因为前孵育液pH的不同，ATP酶染经过多硫化铵显色之后，根据颜色深浅不一可分为不同的纤维类型。I型因肌纤维收缩较慢而活动持久，其ATP酶活性高，染色深；Ⅱ型是收缩快，但是活动不持久，其ATP酶活性低，染色淡。各种ATP酶染色解果均可明显看见正常骨骼肌纤维分为I型和Ⅱ型，两种类型肌纤维交织排列，且横切面多呈椭圆形大小均匀，形状规则，纵切面看见肌肉纤维条状分布。比较不同染色方法和孵育条件的染色效果显示：4℃过夜滴染的染色效果较恒温箱37℃滴染的效果好；37℃浸染的效果比4℃过夜浸染的效果好，虽然浸染过夜容易产生沉淀，但是过滤ATP酶孵育液后再使用，染色效果仍然好 (图 1)。

讨 论

组织化学染色是利用组织细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。在一定的条件下全酶进行催化作用，产生一种可见产物，沉淀在酶所在的部位，最终通过显微镜对酶的活性进行定位或定量研究[3]。经典的ATP酶的染色更是在临床肌肉组织疾病的诊断起着非常重要的作用。根据组织化学、超徽结构、生化和生理特点可把肌肉纤维分类为I型、Ⅱ型(包括ⅡA、ⅡB)。I型与Ⅱ型相比，I型的ATP酶活性低，收缩启动慢，氧化能力高，糖酵解能力低，比Ⅱ型更耐疲劳。Ⅱ型纤维又可以分为ⅡA、ⅡB两个亚型，两者相比，ⅡA型的ATP酶活性高，收缩启动快，氧化能力高，糖酵解能力高，比ⅡB更耐疲劳。ⅡB型的ATP酶活性高，收缩启动快，氧化能力低，糖酵解能力高，比ⅡA更耐疲劳[4]。在肌肉疾病发生、发展过程中肌纤维形态和类型均随之变化，如I型肌纤维变化比较明显的情况常见于肌强直性肌萎缩、线状体肌病等；II型纤维改变常见于重症肌无力、急性去神经支配的肌肉组织等。有些疾病如肢带型肌营养不良可见两型纤维均肥大。相反萎缩型病变也可选择性地累及某一型纤维[5]。

在普通HE染色观察的基础上，取新鲜肌肉组织进行病理组织检查是根据肌肉酶活性的特点采用经典的ATP酶特殊染色方法，此法在临床神经肌肉病变诊断中具有重要的作用。而新鲜肌肉标本的ATP酶染色过程复杂，步骤多并且耗时长。但是在骨骼肌临床病理诊断中以及相关的医学基础研究中采用此方法，可以清楚地观察到两种肌纤维的形态、分布和比例的变化[6]，因此，秉承经典方法的同时并不断改进和总结具有重要意义。ATP酶组织化学技术已沿用多年，在经典方法的基础上有过实验者的改进和不断的完善[7]，总结各种改良之后方法发现效果还是有不同程度的差异。滴染法沿用我科张萌老师的方法[6]，在送检标本极少的时候且在不影响诊断的前提下可以节约一定成本。在标本量比较多时，玻片数量多时采用浸染的方法更能取得好的染色效果。采用4℃孵育，适合肌肉病变过程中有能量反应减弱时候，虽然结合缓慢，但结合效果比较好，非特异染色也比较少。总结此次实验：改变孵育条件，滴染4℃过夜的染色深度比恒温箱37℃的效果好；改变孵育方法，浸染的37℃比浸染4℃过夜效果好，浸染过夜容易有沉淀，但是过滤之后染色效果仍然满意。

图1 不同染色方法与孵育条件ATP酶活性染色效果比较。A和B，4℃滴染；C和D，37℃滴染；E和F，4℃浸染；G和H， 37℃浸染；A、C、E和G，前孵育液pH4.35；B、D、F和H，前孵育液pH10.4 ；比例尺，20μmFig. 1 Comparison of the staining effects of ATPase activity using different methods. A and B, dropping stain at 4°C; C and D, dropping stain at 37°C;E and F, dipping stain at 4°C; G and H, dipping stain at 37°C; A, C, E and G, pH4.35; B, D, F and H, pH10.4; scale bar, 20μm

应用这些方法染色时，应注意以下事项：①冰冻切片前应注意保存在液氮罐的肌肉标本必须提前拿出放入-25℃左右解冻，时间至少8h或者过夜。②需严格并精确调试所用试剂的pH值，标准液必须保证新鲜且准确，标准曲线的误差应控制在0.1之内。③将肌组织切片事先在不同pH的液体内进行前孵育，可以抑制某一型肌纤维的ATP酶活性。如碱性环境中抑制I肌纤维ATP酶活性，因此经碱性孵育液孵育，Ⅱ型纤维着色深，I型纤维无色。而酸性环境抑制Ⅱ型肌纤维的ATP酶活性，经酸性孵育液孵育后，I型纤维着色最深，Ⅱ型纤维无色，要求孵育液的pH值一定要测量准确，可允许的误差范围0.1。碱性前孵育液保存期间pH易发生改变，染色效果变差，一般应现配现用。酸碱前孵育结束可以过水，但切忌过自来水冲洗，因为自来水中化学离子会影响已经调试好pH反应环境。④过滤：ATP酶孵育液完全溶解之后，在加入条件为4℃冰箱过夜需要过滤，否则很容易形成沉淀，导致背景沉积杂质。⑤ATP酶的染色结束后进行常规脱水透明封片，不宜在二甲苯中浸泡太久，否则容易脱色。

在临床操作中经典的染色方法在客观条件影响下，结果差异时常有，但是为了达到很好的显色效果，根据实际条件选择合适的孵育方法，提高染色跟诊断的时效性，更有助于临床工作进展。