液泡分选蛋白4B在小鼠牙胚发育的时空表达

陈栋 李晓聪 鲁方丽 王莹莹 李强

液泡分选蛋白成员(vacuolar protein sorting, VPS)参与调控多种细胞过程：包括细胞增殖[1]、自噬[2]和微卫星不稳定[3]等。研究证实，VPS4B在溶酶体降解、细胞内蛋白转运、病毒出芽等过程起着重要作用[4]。目前对于该蛋白的研究主要集中在其对肿瘤细胞增殖及耐药的影响[5]，在牙齿发育过程中的作用鲜有报道。前期课题组收集到1 例河南遗传性牙本质发育不良I型(dentin dysplasia type I, DD-I)家系，表现为常染色体显性遗传，患者均表现出牙冠形态、颜色正常，而牙根短小发育畸形，髓腔及根管部分闭锁。通过对外周血进行基因测序，发现该家系患者中都存在VPS4B基因突变(IVS7+46C>G)[6]。自1973 年Shields[7]根据临床及X线表现将此类疾病分为牙本质发育不全和牙本质发育不良以来，已证实多种亚型均为DSPP基因突变所致，但在DD-I患者中未发现该基因突变，导致此亚类的致病机制仍不明确。本研究拟通过观察VPS4B在小鼠磨牙发育过程中的表达与分布，初步探讨其在牙齿发育过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、设备

8 周龄健康C57BL/6J雌鼠25 只雄鼠10 只(济南朋悦)；柠檬酸抗原修复液、PBS、兔抗小鼠VPS4B抗体(博奥森)；SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德)，切片机(Leica，德国); 光学显微镜及照相系统(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 标本的制备 将c57雌雄小鼠以3∶1比例合笼，孕栓出现当日中午定为胚胎发育第0.5天(E0.5)，新生鼠鼠龄计算以出生当天中午定为出生后第0.5天(P0.5)。脱颈处死E13.5、E14.5、E16.5孕鼠及P2.5、P7幼鼠，取胎鼠头部及幼鼠下颌骨组织，浸于4%多聚甲醛中于4 ℃下固定24 h，流水冲洗后脱水、透明、包埋，制备5 μm连续切片备用(其中新生幼鼠下颌骨固定后需先在10%EDTA溶液中脱钙)。