脂联素转染的内皮祖细胞对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

王美瑶 刘煜敏 李艳 张仁伟 张帅美 封红亮

缺血性脑卒中在全球范围内具有较高发病率、致残率、病死率的特点[1]，2型糖尿病(T2DM)是其主要的危险因素之一。研究表明，T2DM患者比非T2DM患者发生缺血性脑卒中的风险高出2倍，同时合并有T2DM的缺血性脑卒中患者其神经血管损伤也更广泛，预后更差，再发脑梗死的风险更高[2]。因此，研究T2DM伴发缺血性脑卒中的治疗措施显得尤为重要。近年来随着干细胞研究和应用的不断深入，细胞治疗逐渐成为了缺血性疾病的治疗方法。1997 年得以发现并逐渐阐明的血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)是定居于骨髓中，当缺血缺氧、炎性介质释放等刺激后从骨髓中向外周循环血液中迁移，定向归巢到缺血部位进行增殖分化,参与生理性和病理性血管形成的骨髓干细胞[3]，它在促神经血管修复和改善神经功能缺损方面发挥了重要作用[4]。但T2DM患者循环血中EPCs含量降低，其迁徙增殖活性和血管代偿性增生的能力下降，其下降程度与缺血性疾病的不良预后呈正相关[5]。脂联素(Adiponectin，APN)一种主要是由脂肪组织合成和分泌的蛋白质，因其在改善胰岛素抵抗、抗糖尿病等方面发挥着广泛的生物学效应而备受关注[6]。APN除了代谢相关功能，它还具有抗炎作用从而发挥脑保护作用[7]，同时APN还具有参与调控EPCs迁移、增殖、分化功能的作用[8]。我们先前的研究表明APN基因修饰的EPCs可能是治疗非T2DM大鼠脑缺血再灌注损伤(I/R)的一种有效的方法[9]。本研究将建立T2DM伴I/R损伤大鼠模型，给予APN转染的EPCs(LV-APN-EPCs)干预，观察LV-APN-EPCs对T2DM伴脑I/R损伤大鼠的治疗效果及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SPF级SD大鼠(4周龄、体重90～100 g的大鼠10只；5周龄、体重150～160 g的大鼠70只)，购自湖北省实验动物研究中心，动物合格证号SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2 主要试剂和仪器 60 kcal%高脂饲料(D12492)购于北京华阜康公司；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；血糖仪及配套血糖检测试纸购于美国Johnson & Johnson公司；EPC专用培养基EGM-2MV培养基购于美国Lonza公司；带有绿色荧光蛋白和大鼠APN基因的慢病毒载体和带有绿色荧光蛋白空载基因的对照慢病毒均购于上海吉凯基因公司；CD31抗体购于美国Abcam公司；大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的ELISA试剂盒均购于南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及细胞干预 将70只5周龄SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、对照组(PBS组)、LV-APN-EPCs治疗组、LV-EPCs治疗组和EPCs治疗组，每组各14只；高脂饲料喂养大鼠2周，以35 mg/kg剂量腹腔注射STZ，继续喂养2周后检测空腹血糖，含量≥16.7 mmoL/L判定为T2DM大鼠造模成功；麻醉PBS组、LV-APN-EPCs组、LV-EPCs组和EPCs组大鼠，longa法[10]制备I/R模型，sham组除不插入线栓外，其余步骤相同。10只4周龄SD大鼠，梯度密度离心法获取骨髓单个核细胞层，添加EGM-2MV培养基，于5% CO2和37 ℃的培养箱中培养，每3～4 d更换1次培养基;细胞生长至第7 d随机分成3组：正常对照组(EPCs组)、携带APN基因的慢病毒转染组(LV-APN-EPCs组)和空白慢病毒转染组(LV-EPCs组)。EPCs组继续换液培养，LV-APN-EPCs组和LV-EPCs组细胞消化获取细胞悬液，按照转染倍数=100分别按组加入携带有绿色荧光蛋白与大鼠APN基因的慢病毒载体和带有绿色荧光蛋白空载基因的对照慢病毒，培养第14 d消化下各组细胞;T2DM大鼠I/R 1 h后经尾静脉分别给予LV-APN-EPCs组、LV-EPCs组和EPCs组每只大鼠1×106/ml LV-APN-EPCs、LV-EPCs和EPCs 1mL，在相同时间点经尾静脉注射sham组、PBS组大鼠PBS溶液1 mL。

1.2.2 神经功能评分 5组大鼠分别于I/R前和I/R后第1、7、14 d，参照改良大鼠神经功能缺损评分(modified neurological severity score，mNSS)[11]进行神经功能评分，评分为0～18分，0分为无明显神经功能缺损症状，18分为神经功能缺损最严重。

1.2.3 HE染色 5组大鼠I/R后第14 d行HE染色；10%水合氯醛麻醉大鼠，4%多聚甲醛经心脏进行全身灌注内固定，断头取脑，从视交叉前缘始向后切3 mm厚冠状位脑组织块，石蜡包埋，连续切片，每片标本厚度约10 μm；常规HE染色，普通光镜下观察脑组织形态学改变。

1.2.4 CD31免疫荧光染色 5组大鼠I/R后第14 d，行CD31免疫荧光染色检测缺血区血管密度;使用CD31抗体对脑切片进行免疫荧光染色后免疫荧光显微镜下观察脑缺血区周围皮质的新生血管情况，随机取多个视野计算荧光密度。

1.2.5 缺血脑组织炎症指标水平检测 5组大鼠I/R后第14 d，ELISA 法检测缺血脑组织中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白介素-1β (IL-1β)水平；10%水合氯醛麻醉大鼠，生理盐水经心脏进行全身灌注后断头取脑，取脑梗死周围皮质制成匀浆液，根据ELISA试剂盒说明书进行操作检测炎症指标水平。

2 结 果

2.1 大鼠T2DM模型评估 高脂饮食结合STZ诱导制备T2DM模型前后各组大鼠的空腹血糖水平见图1，所有大鼠在诱导后血糖均≥16.7 mmol/L，各组大鼠均出现多饮、多食、多尿等症状，判定为T2DM大鼠造模成功。

图1 各组大鼠糖尿病造模前后血糖水平 与高脂+STZ诱导前比较,*P<0.05

2.2 神经功能评分 T2DM大鼠I/R后第7 d，LV-APN-EPCs组大鼠的mNss评分低于LV-EPCs组、EPCs组和PBS组[(5.60±0.52)与(7.70±0.82)、(8.20±1.14)、(9.30±0.82)分，P<0.05]；I/R后第14 d，LV-APN-EPCs组大鼠的mNss评分低于LV-EPCs组、EPCs组和PBS组[(4.50±0.53)与(6.40±0.52)、(6.50±0.71)、(7.80±0.63)分，P<0.05](图2)。

图2 各组T2DM大鼠I/R前和I/R后第1、7、14 d神经功能评分 与PBS 组比较,#P<0.05;与LV-EPCs组和 EPCs组比较,*P<0.05

2.3 各组大鼠脑组织HE染色比较 与LV-EPCs组、EPCs组和PBS组比较，LV-APN-EPCs组大鼠神经元破坏明显减轻，变性、坏死的神经元减少，间质内浸润的炎性细胞减少，细胞结构破坏减轻，胞质中空泡减少(图3)。

2.4 脑组织缺血区血管密度的检测 免疫荧光显微镜观察显示，LV-APN-EPCs组大鼠脑组织缺血区皮质血管密度高于LV-EPCs组、EPCs组和PBS组[(209.00±9.25)与(125.00±11.29)、(138.40±9.15)、(80.20±16.22)，P<0.05](图4)。

图3 各组大鼠缺血侧脑组织病理学表现(HE染色 ×400倍) A为sham组;B为PBS组;C为LV-APN-EPCs组;D为LV-EPCs组;E为EPCs组

图4 各组大鼠缺血侧脑组织血管密度(CD31免疫荧光染色 ×400倍) A为sham组;B为PBS组;C为LV-APN-EPCs组;D为LV-EPCs组;E为EPCs组;与PBS 组比较,#P<0.05;与LV-EPCs组和 EPCs组比较,*P<0.05

2.5 缺血脑组织皮质炎症指标水平的检测 ELISA显示LV-APN-EPCs组大鼠脑组织缺血区皮质TNF-α水平低于LV-EPCs组、EPCs组和PBS组[(236.87±8.10)与(309.78±12.32)、(325.44±16.64)、(385.24±15.33)pg/mL，P<0.05]；LV-APN-EPCs组大鼠脑组织缺血区皮质IL-1β水平低于LV-EPCs组、EPCs组和PBS组[(107.05±12.22)与(125.29±4.22)、(120.68±12.59)、(142.59±8.50)pg/mL，P<0.05](图5)。

图5 ELISA法检测各组大鼠脑组织TNF-α和IL-1β表达水平 与PBS组比较,#P<0.05;与LV-EPCs组和 EPCs组比较,*P<0.05

3 讨 论

缺血性脑卒中对人类的健康和生命造成了较大的威胁，缺血性脑卒中的发生减少了脑血流，通过激发血管重塑后促进血管新生而改善血液供应[12]。然而，糖尿病导致血管内皮细胞功能受损和功能失调性血管再生的发生，使缺血性脑卒中的预后更差，对人类的威胁也就更大，故研究治疗合并糖尿病的缺血性脑卒中的方法具有重要意义。本研究采用高脂饮食结合低剂量的STZ诱导T2DM大鼠模型，使大鼠处于糖尿病状态[13]，再采用线栓法制备I/R模型，栓塞大脑中动脉2 h后退出栓线以实现缺血再灌注损伤，模拟临床上糖尿病患者I/R过程。

目前，血管再生医学十分令人注目。血管再生是体内修复受损血管的一个重要过程，它包括两个基本过程，也就是血管生成和血管新生。血管生成从已存在的血管以生芽方式长出新毛细血管的过程，而血管新生是内皮前体细胞(如EPC)分化成内皮细胞，形成原始血管网的过程。EPCs源于骨髓细胞，当受到缺血等刺激时循环到外周血中促进血管内皮细胞修复和促进血管再生。近年来研究表明，EPCs移植治疗在各种缺血性疾病中发挥了积极的作用，它定向归巢到脑缺血区域、增殖分化、参与血管再生，从而发挥脑保护作用。Fan 等[14]研究发现通过移植EPCs治疗MCAO小鼠可以改善大鼠的神经功能并减小脑梗死体积。Kong等[14]将骨髓源性的EPCs干预 MCAO模型大鼠，证实EPCs通过促进血管新生形成新的血管。本研究发现EPCs移植可以增加血管密度和改善神经功能，发挥对缺血性脑卒中的保护作用，它可能的机制是低灌注的脑组织释放炎症介质，导致EPCs归巢到脑缺血组织区域，迁移分化为内皮细胞参与血管修复和血管再生，从而恢复血流和改善神经功能。然而，单独移植EPCs，因仅有少量的EPCs存活并归巢到脑缺血区域，治疗效果不佳，同时糖尿病状态进一步减少了循环EPCs数量，T2DM大鼠的EPCs的归巢、迁移、分化、成管等功能受损[15]，使EPCs很难充分发挥其作用。因此，保证EPCs的数量及功能是治疗合并糖尿病的缺血性脑卒中的重要手段。

APN在调节糖脂代谢、抗动脉粥样硬化形成、抗炎、保护血管内皮等方面发挥较大生物学作用[16]。Nakamura等[7]发现APN通过PI 3-kinase/Cdc42/Rac1通路促进 EPCs迁移。Huang等[17]研究证实APN通过增加内皮型NO合酶的表达而减轻高糖状态下EPCs功能受损。TNF-α和IL-1β是重要的神经炎症因子，Chen等研究表明APN通过下调TNF-α和IL-1β水平来发挥抗炎作用，有效地改善糖尿病患者的EPCs生物学功能，从而提高EPC治疗性血管新生的作用[18]。故本研究将携带有APN基因的慢病毒转染到EPCs，干预T2DM脑I/R损伤大鼠，研究LV-APN-EPCs对I/R的T2DM大鼠的神经保护作用，将对合并有T2DM的缺血性脑血管病的治疗提供新的思路。

改良大鼠神经功能缺损(mNSS)评分用于评估大鼠的神经功能，本研究结果表明LV-APN-EPCs治疗较LV-EPCs组、EPCs组和PBS组明显改善了T2DM大鼠I/R损伤的神经功能缺损。通过HE染色观察发现，LV-APN-EPCs干预后T2DM大鼠神经元的损伤程度减轻。另外，CD31免疫荧光染色显示LV-APN-EPCs干预后T2DM大鼠脑组织缺血区血管密度均较其他干预组增加，ELISA检测显示脑缺血周围皮质的TNF-α水平和IL-1β水平较其他干预组降低，表明LV-APN-EPCs改善T2DM大鼠神经功能损害可能是通过促进缺血区血管新生，增加缺血区血液供应和抗炎作用来实现的。

综上所述，本研究证实LV-APN-EPCs对T2DM大鼠脑I/R损伤发挥神经保护作用，其可能的机制是促进缺血区血管的修复、再生和抑制炎症因子表达。