胃酶抑素A通过上调p-ERK1/2的表达来保护大鼠脑缺血再灌注损伤

蔡丽 张智博 毛新发 范卫兵

脑缺血病灶半暗带区神经细胞程序性死亡的主要形式为凋亡[1]。多种细胞因子及信号途径参与脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的调控。胃酶抑素A(Pepstatin A)为组织蛋白酶D(cathepsin D，Cat D)的特异性抑制剂。在Amritraj等的研究中Pepstatin A可通过抑制Cat D的表达，减少细胞色素C及凋亡执行蛋白酶胱天蛋白酶3(Caspase-3)的释放，减少神经元凋亡[2]。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2)为Ras-Raf-MEK-ERK信号通路的最下游蛋白，其发生磷酸化激活后可由胞质转位到核内，参与细胞的增殖、分化及凋亡等一系列活动的调节[3]。在多数神经细胞的离体和在体模型中ERK1/2信号通路发生磷酸化活化后可抑制Caspase-3的表达，抗神经细胞调亡[4-5]。Pepstatin A及p-ERK1/2均可调节脑缺血再灌注后半暗带区神经元的凋亡，但尚未有研究证实两者之间是否相关。本实验采用局灶性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，检测脑梗死体积、脑缺血2 h再灌注24 h后p-ERK1/2及Caspase-3的表达水平以及使用Pepstatin A干预后脑梗死体积、p-ERK1/2、Caspase-3表达水平的变化，旨在探讨Pepstatin A保护大鼠脑缺血再灌注损伤的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

10～12周龄雄性健康Sprague-Dawley大鼠48只，体重(260±20)g，清洁级，由湖南省东创实验动物中心供给，许可证号：SYXK(湘)2010-0013。饲养环境：湿度50%～60%，室温22～24℃，敷料干洁，通风良好，自由饮水摄食。依照随机数字表法分配至假手术组(16只)、生理盐水(对照)组(16只)及Pepstatin A干预组(16只)，假手术组、生理盐水(对照)组、Pepstatin A干预组中随机各取8只检测脑梗死体积，余下8只行 western blot检测p-ERK1/2及Caspase-3的表达水平。本实验严格遵守科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 动物模型制作及行为学评价

参用改良的Longa线栓法制作大鼠右侧MCAO再灌注模型。10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，颈前正中切口，显露并分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，将颈总动脉近心端及颈外动脉远心端结扎，夹闭颈内动脉近心端，用眼科剪在颈总动脉近分叉处剪一小口，插入栓线至其进入颈内动脉约(18±0.5)mm遇轻微阻力时停止，2 h后拔出线栓形成再灌注。假手术组插入线栓长度约10 mm。术中予照射灯保持大鼠肛温在(37.0±0.5)℃，将术后大鼠单独饲养，保持鼠笼温暖干燥，并监测呼吸、心率及体温。

缺血2 h实现再灌注24 h时遵照Longa’s5级标准评分法评价首次神经功能缺损评分。0分：行为学表现正常；1分：垂直提起大鼠时左侧前爪屈曲在胸前，不能伸直；2分：行走时身体向左侧转圈或者偏斜；3分：行走时身体向左侧倾倒；4分：有意识丧失，不能自主行走。纳入造模成功评分为1～3分的大鼠，评分为0分或4分、提前死亡、处死时发现蛛网膜下腔出血的大鼠弃之不用，并随机补充。

1.3 胃酶抑素A干预

干预组于缺血再灌注即刻经腹腔注射Pepstatin A配置液0.2 mL/10g(美国Sigma公司，粉剂，1 mg Pepstatin A经1 mL二甲基亚砜溶解后再用生理盐水稀释至100 mL，最终浓度为0.01 mg/mL)，对照组在相应时间点经腹腔注射等体积生理盐水。

1.4 脑梗死体积测定

各组大鼠在缺血2 h再灌注24 h完成评分后迅速断头取脑，置于-20 ℃冰箱中冷冻20 min，按2.0 mm厚度行视交叉后冠状位连续切片，可得5～6片，避光浸泡于1%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)磷酸盐缓冲液中，于37 ℃恒温箱孵育15 min；正常脑组织经反应后呈红色，梗死脑组织则颜色苍白。将处理后的脑组织置于4%多聚甲醛配置液中固定24 h后拍照，使用Image-pro plus7.0图像分析软件计算各层脑组织梗死区面积与总面积，按以下公式计算相对脑梗死体积：相对脑梗死体积=(Σ梗死面积/Σ全脑片面积)×100%。

1.5 Western blot检测p-ERK1/2、Caspase-3的表达水平

取缺血侧皮层组织约100 g(冠状面距额极7～11 mm)，冰浴下充分匀浆，4 ℃离心(12000 r/min×10 min)，移取上清液至-80 ℃冰箱保存备用，采用BCA法测定蛋白水平。取相应组别等量目的蛋白制品，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过半干转法转移至硝酸纤维膜，放入封闭液(5%的脱脂奶粉)中封闭，在不同组别中分别加入一抗溶液p-ERK1/2抗体(1∶1000，Bioworld公司)、Caspase-3抗体(1∶1000，SantaCruz公司)，4 ℃过夜孵育，辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG二抗(1∶4000，SantaCruz公司)，室温孵育2 h，暗室曝光，柯达洗片机洗片，胶片扫描，片上显示目的蛋白条带，用Quantity One图像分析软件计算相应目标条带的光密度值，以目的蛋白条带与内参条带(beta-action 肌动蛋白)光密度值的比值为检测指标。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 行为学评价

假手术组的神经功能缺损评分为0分，干预组的神经功能缺损评分均显著低于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 各组神经功能缺损评分、脑梗死体积、p-ERK1/2、Caspase-3表达水平比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05(n1为行为学评分组样本量，n2为其余组样本量)

2.2 脑梗死体积

TTC染色显示假手术组脑组织染色呈红色，未见白色梗死灶；对照组及干预组均可见体积各异的白色梗死灶；2组相对脑梗死体积依次为(18.24±2.28)%和(15.44±1.40)%，其差异明显(P<0.05)(表1，图1)。

图1 TTC染色 A为假手术组;B为生理盐水(对照)组;C为干预组

2.3 脑缺血皮质p-ERK1/2和Caspase-3的表达水平

Western blot检测显示对照组中p-ERK1/2蛋白的表达水平显著高于假手术组(P<0.05)；干预组中p-ERK1/2蛋白的表达水平较对照组显著增加(P<0.05)(表1，图2)；干预组Caspase-3蛋白的相对表达水平则显著低于对照组(P<0.05)(表1,图3)。

图2 Western blot检测各组p-ERK1/2蛋白表达水平

图3 Western blot检测各组Caspase-3的表达水平

3 讨 论

缺血再灌注损伤神经元凋亡的调控涉及多个细胞因子及信号途径，形成1个交互作用的复杂体系[6]。体内及体外研究结果表明，Pepstatin A与p-ERK1/2均涉及神经细胞凋亡的调节。

Pepstatin A具有易合成、耐热性好、性质稳定、毒性低等特点，可强有力地抑制Cat D[7]。现有研究表明，在神经细胞、人类成纤维细胞、肿瘤细胞等中Pepstatin A具有抗细胞凋亡的保护作用[2, 8]。本研究Pepstatin A干预组的神经功能缺损评分、相对脑梗死体积以及Caspase-3的表达水平均显著低于生理盐水(对照)组。这提示Pepstatin A可改善大鼠脑缺血再灌注损伤的神经功能缺损，减少脑梗死体积及神经元凋亡，发挥神经保护作用。

Ras-Raf-MEK-ERK信号通路主要通过ERK1/2的磷酸化来调节细胞命运的转归，p-ERK1/2活化的强度和持续时间为该信号途径通向生存或死亡的关键[4, 9]。在多种脑缺血模型的实验中如大鼠MCAO、缺血预处理模型、缺血缺氧模型等p-ERK1/2的表达水平均显著增加，其激活具有神经保护作用[10-12]。本研究对照组p-ERK1/2蛋白的表达水平在缺血2 h再灌注24 h后较假手术组显著增加，提示可能为缺血再灌注损伤中促凋亡因子释放增多，p-ERK1/2的表达反应性增加以对抗其脑损伤作用。

Pepstatin A抗凋亡神经保护作用的机制主要通过抑制Cat D蛋白的表达实现。Cat D调节细胞凋亡主要通过以下三条路径：第一，作用于经典途径如死亡受体途径或线粒体途径，而Bcl-2家族蛋白(Bax、Bid、Bcl-2等)为重要载体；第二，与炎症细胞及炎症因子相互关联，从而诱发炎症反应；第三，激活凋亡相关信号途径，抑制生存信号途径[13-15]。而Yoshida等的研究结果表明，Pepstatin A可抑制受体活化素配体诱导的成骨细胞的增殖分化，该效应是通过阻止ERK1/2信号通路实现的，提示Pepstatin A可通过ERK1/2信号通路发挥其生理作用[16]。P-ERK1/2经线粒体途径及死亡受体途径调控细胞凋亡则主要是通过与Bcl-2家族蛋白(主要为Bid、Bcl-2等)的相互作用[17-18]。本研究使用Pepstatin A干预后p-ERK1/2的表达水平较对照组明显增高，干预组Caspase-3蛋白的表达较对照组减少，提示Pepstatin A可能通过上调p-ERK1/2的表达来保护大鼠脑缺血再灌注损伤，抗细胞凋亡，Bcl-2家族蛋白可能为他们之间相互作用的关键靶点。

综上所述，Pepstatin A可能通过上调p-ERK1/2的表达，减少脑梗死体积及细胞凋亡发生，从而保护大鼠脑缺血再灌注损伤。本研究仍存在一些缺陷，即第一，p-ERK1/2表达检测时间点有限，无法动态完整体现其趋势变化；第二，未行Tunel法检测细胞凋亡计数，定量体现Pepstatin A的抗凋亡作用；第三，Pepstatin A上调p-ERK1/2信号通路具体的作用靶点仍不明确，尚需进一步研究。应开拓思维，使脑缺血再灌注损伤的机制体系逐渐完善，给缺血性脑血管病的治疗提供新的途径。