GLI-1信号途径参与低氧诱导的宫颈癌Hela细胞侵袭的作用机制研究

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(1.重庆市九龙坡区人民医院妇产科，重庆 400050；2.重庆医科大学附属第一医院妇产科，重庆 400042；3.陆军军医大学第一附属医院妇产科，重庆 400038；4.重庆市九龙坡区西彭镇卫生院外科，重庆 401326)

宫颈癌是临床上常见的妇科恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的半数以上，其发病率和病死率均居发展中国家妇女恶性肿瘤前列[1-2]。宫颈癌的远处浸润性侵袭转移是导致宫颈癌患者死亡的最主要原因[3]，抑制宫颈癌细胞的侵袭能力是有效治疗的关键环节，然而目前关于细胞侵袭转移的机制并不十分清楚，这成为制约宫颈癌治疗的瓶颈，因此，研究宫颈癌细胞的浸润和侵袭机制有重要的临床意义。

恶性实体肿瘤在快速生长过程中，由于肿瘤细胞的过度增殖必然会造成局部组织严重缺氧，造成供氧与耗能之间的不平衡[4]。局部低氧微环境是实体瘤的特征之一，其对维持肿瘤细胞能量代谢、新生血管形成以及增强肿瘤细胞侵袭能力起重要作用[5]。低氧能够通过激活一系列下游信号通路，从而对肿瘤的发生发展各个阶段进行调控[6-7]。近年来研究发现，Hedgehog(Hh)信号传导通路在低氧环境下能够激活，且在结肠癌、乳腺癌以及肝癌等多种恶性肿瘤组织中异常高表达，与恶性肿瘤的异常增殖和侵袭转移密切相关[8-11]。有研究表明，GLI-1作为Hh信号通路的转录因子激活并转录了Hh信号通路大部分靶基因，并有可能参与了宫颈癌细胞的远处侵袭[12]。而在低氧环境下，GLI-1基因在宫颈癌远处侵袭中的研究尚未见报道。本研究旨在模拟低氧微环境，探讨低氧微环境对人宫颈癌Hela细胞侵袭能力的调控及其可能分子机制，进一步揭示GLI-1在宫颈癌细胞远处侵袭中的作用机制，为宫颈癌的临床诊断及治疗提供新的理论依据和治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 材料

人宫颈癌Hela细胞株购自中国典型培养物保藏中心(武汉)；Silencer TM Select GLI-1 siRNA委托上海吉玛生物科技公司设计合成；总RNA 提取试剂盒购自日本宝(Takara)生物科技公司；β-actin、GLI-1、MMP2和MMP9 PCR引物由上海天一辉远生物公司设计合成；多克隆兔抗人GLI-1、HIF-1α和β-actin抗体购自美国Abcam公司，辣根酶标记羊抗兔IgG购自武汉博士德生物公司；中分子量Protein marker购自Thermo Fisher公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Millipore公司；胎牛血清购自杭州四季青生物科技公司；RPMI 1640培养液购自美国GIBCO公司；细胞及组织蛋白裂解液(RIPA)购自碧云天生物技术研究所；Pierce BCA蛋白分析试剂盒购自美国Thermo Scientific公司;0.45 mm PVDF膜购自美国Millipore公司；6孔板、25 cm2塑料培养瓶均购自海狸生物科技有限公司；24孔transwell小室(孔径8 μm)购自美国Corning公司；侵袭实验所用基底膜基质胶(Matrigel)购自美国BD公司；Co170R-230-0200三气细胞培养箱(用于模拟缺氧细胞培养环境)购自德国Eppendorf公司；倒置相差显微镜购自日本Olympus公司；水平电泳槽、垂直电泳槽、转移电泳槽购自北京六一电子仪器公司。

1.2 细胞培养

人宫颈癌Hela细胞株在37 ℃、5%CO2饱和湿度条件的细胞培养箱中用含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL庆大霉素的RPMI 1640培养基进行细胞培养。采用0.25%胰蛋白酶消化传代。取第三、四代处于对数生长期的细胞进行后续实验。细胞培养至融合70%～80%后，用无血清培养基饥饿过夜，再将细胞分别置入常氧和低氧环境下处理指定时间，按实验要求分组。

1.3 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

β-actin 引物序列:上游5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3’，下游5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’；GLI-1 引物序列:上游5’-CCGTCATCTCCGACTTCATCT-3’，下游5’-GTGTCTCCTCCCTGTTGTTCTG-3’；HIF-1α引物序列:上游5’-TCAACACGACACCGGATAAA-3’，下游5’-CCGCGAGCTATCTTTCTTCA-3’。PCR反应条件:94 ℃预变性2 min，94 ℃ 变性20 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共进行32个循环，最后72 ℃延伸5 min，扩增产物4 ℃保存。对实时定量PCR仪结果进行统计分析。

1.4 Western blot检测

将Hela细胞分别置于常氧和低氧环境下培养24 h，处理完毕后将6孔板中的贴壁细胞用预热的PBS洗涤3次后在RIPA裂解液中进行裂解。随后用塑料细胞刮将细胞轻柔刮下，并转移到EP管，置于冰上裂解15 min。随后于12 000 r/min离心5 min，弃去沉淀，将收集到的上清液置于-20 ℃冻存。使用BCA法测蛋白浓度，随后上样，先用80 V电泳积聚蛋白，随后用120 V电压使蛋白分离并转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h。使用多克隆兔抗人GLI-1、HIF-1α和β-actin抗体分别与PVDF膜接触4 ℃孵育过夜后，用TBST在脱色摇床下洗膜5 min×3次，随后加辣根酶标记羊抗兔IgG，室温下孵育1 h后，用TBST洗膜5 min×3次。随后加入ECL化学发光液进行曝光，图片扫描，用Quality One分析软件将图片上的特异条带灰度值数字化， 并与内参灰度值比较得出每次实验的相对数值。

1.5 小干扰RNA转染

提前在4 ℃融解Matrigel基质胶，每个聚碳酸酯微孔膜表面铺以40 μL稀释的Matrigel胶(matrigel与无血清培养基之比为1∶3)，放入培养箱待用。选取对数生长期的细胞以每孔3×105个细胞接种至于6孔板上，培养24 h后待细胞密度达到50%～60%，更换无血清培养基并按照LipofectamineTMRNAi MAX转染试剂说明书进行GLI-1干扰引物的转染，同时设立空白对照组(Control SiRNA)。每组各设2个孔，每孔GLI-1 siRNA及空白对照siRNA的浓度均为100 nmol/L。转染6 h后更换新的无血清培养基。转染48 h后提取各组样本的mRNA及蛋白，实验重复3次。

1.6 Transwell 细胞侵袭实验

细胞侵袭试验：提前在4 ℃融解Matrigel基质胶，每个聚碳酸酯微孔膜表面铺以40 μL稀释的Matrigel胶(matrigel与无血清培养基之比为1∶3)，放入培养箱中4 h凝固备用。将处于对数生长期的Hela细胞在无血清RPMI 1640培养液饥饿培养24 h后,使用0.25% EDTA胰蛋白酶消化，接着无血清RPMI 1640培养基悬浮成单细胞悬液。将200 μL的不含血清Hela细胞悬液以1×108/L接种于Transwell上室(Corning)，下室加入600 μL的含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液，每组设3个复孔。实验按如下分组:常氧对照组、低氧组、常氧对照+GLI-1 siRNA组，低氧+GLI-1 siRNA组。在培养箱中培养48 h后，取出Transwell小室，弃培养液，甲醇固定20 min，将小室室温风干5 min，采用0.1%结晶紫染色20 min;PBS洗3遍，湿棉签擦尽上室面细胞，光学显微镜下随机选取5个视野，计数小室下室面的细胞数，每组设3复孔，取平均值做统计分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 低氧微环境促进宫颈癌Hela细胞体外侵袭能力

在不同氧浓度下培养Hela细胞48 h，以正常培养细胞为对照组，结果显示，低氧处理组中Hela细胞的侵袭能力显著增强，与常氧组相比差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

2.2 低氧微环境上调Hela细胞HIF-1α、GLI-1基因表达

经过常氧和低氧环境下分别处理后24 h后，RT-PCR及Western Blot结果显示，与常氧培养组相比，低氧培养的Hela细胞的HIF-1α、GLI-1 mRNA和蛋白表达水平显著升高(图2)。

2.3 GLI-1 siRNA 靶向抑制Hela细胞 GLI-1 mRNA和蛋白表达水平

转染GLI-1特异性siRNA及GLI-1-NC siRNA于Hela细胞48 h后，分别采用RT-PCR和Western blot检测GLI-1 mRNA和蛋白表达。结果显示，与GLI-1阴性对照组和空白对照组相比，GLI-1 siRNA组的GLI-1明显下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

a:常氧；b:低氧;c:Transwell实验各组穿膜细胞数统计分析 *：与常氧组比较，P<0.05

a:RT-PCR检测HIF-1α、GLI-1 mRNA表达；b：Western blot检测HIF-1α、GLI-1蛋白表达；c：Western blot结果定量分析 *：与常氧组比较，P<0.05

图2低氧微环境对宫颈癌Hela细胞GLI-1基因表达水平的影响

a：GLI-1 si-RNA转染荧光图( ×400)；b：RT-PCR检测GLI-1 mRNA表达；c：Western blot检测GLI-1蛋白表达；d：Western blot结果定量分析 *：与阴性对照组比较，P<0.05

图3GLI-1siRNA在Hela中有效沉默GLI-1基因表达

2.4 沉默GLI-1表达减弱低氧诱导的体外侵袭能力

为进一步验证GLI-1是否对低氧微环境诱导的Hela细胞侵袭产生影响，在Transwell小室侵袭实验中，我们发现与低氧组和低氧+NC siRNA组相比，使用GLI-1 siRNA阻断其表达后，低氧培养的Hela细胞的侵袭能力被显著削弱(图4)。

a:常氧;b:低氧;c:低氧+si NC;d:低氧+si GLI-1;e:Tanswell侵袭实验检测细胞侵袭能力统计分析

图4沉默GLI-1抑制低氧微环境诱导的Hela细胞侵袭(结晶紫染色×200)

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，60%的患者确诊时已发展为浸润癌并伴随不同程度的远处侵袭转移，严重影响了宫颈癌的治疗和预后[13]。临床上一旦发生局部浸润，患者生存率则显著降低，而远处侵袭则是导致患者预后差的主要原因[14]。因此，如果能寻找有助于早期预测宫颈癌侵袭转移的相关分子，那么对宫颈癌实施个体化治疗及改善预后都具有重要意义。

大多数实体瘤具有缺氧的微环境，在肿瘤发生发展过程中一个关键的步骤是肿瘤细胞对缺氧的适应[15-16]。为了适应低氧代谢应激条件，肿瘤细胞能够通过激活一系列信号调控机制，如促进周边新生血管生成、增强细胞新陈代谢、迁移等，促进了细胞的异常增殖、转移、耐药等。缺氧微环境可通过调控多种基因表达，从而促进恶性肿瘤发生浸润转移，其中Hedgehog(Hh)信号通路在这一过程中发挥重要作用[17-19]。Hh信号通路在哺乳动物胚胎发育和胚胎形成后细胞的生长和分化过程中具有重要作用，其异常激活几乎参与人体各系统恶性肿瘤的发生[20-21]。GLI-1是Hh信号通路下游分子，其作为核转录因子与启动子结合而激活靶基因转录。研究表明在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌等恶性肿瘤组织中该通路成员SHH、SMO、PTCH、GLI均存在异常激活，表明此通路的激活与恶性肿瘤的发生、发展相关[22-26]。配体SHH可与受体PTCH结合，解除PTCH对SMO的抑制，活化的SMO激活其下游转录因子GLI-1，从而进入细胞核内促进其下游基因转录，促进肿瘤细胞侵袭和浸润[27]。因此，GLI-1不仅是Hh信号通路的关键环节，其上调激活也是该通路活化的标志。研究发现，在宫颈鳞状细胞癌组织中存在GLI-1基因的一场高表达，其可能参与了宫颈癌的发病[28]。

本实验中，我们首先验证了体外低氧微环境对宫颈癌Hela细胞系侵袭能力的影响。结果表明，与常氧对照组相比，Hela细胞经过低氧环境下培养48 h后，细胞侵袭能力显著增强。进一步研究低氧环境下这一现象的分子机制发现，与常氧对照组相比，低氧环境下培养24 h后Hela细胞中Hh信号通路的关键转录因子GLI-1显著激活，提示其可能参与低氧环境下肺癌的侵袭过程。为了进一步明确GLI-1在低氧微环境下Hela细胞侵袭中的作用机制，我们采用特异性GLI-1 si-RNA来阻断其表达，并进一步检测其对细胞侵袭的影响。研究发现，在靶向沉默GLI-1基因之后，低氧介导的细胞侵袭现象被阻断，表明GLI-1在这一过程中起着关键作用。基于以上研究，我们推测低氧通过GLI-1基因来调控下游靶基因转录激活，从而促进宫颈癌细胞的远处侵袭，最终促进宫颈癌的发生发展。

综上所述，本文初步证实在宫颈癌Hela细胞系中低氧微环境能够通过激活Hh信号通路的关键转录因子GLI-1来促进肿瘤细胞的远处侵袭，这将有助于进一步认识宫颈癌的发病机制。因此，深入研究GLI-1基因在宫颈癌发生、发展中的作用及其调节机制，通过靶向阻断GLI-1基因表达，从而抑制肿瘤细胞的远处侵袭，这将为宫颈癌的特异性治疗提供新的思路和依据，具有广泛的临床意义和良好的应用前景。