荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌 耐药基因的结果分析

刘艳 古丽比克·木拉提 玛力亚木·阿布力提甫 易星 李君莲 师永欢 刘天剑

结核病是全球重大传染病之一，严重威胁人类健康[1]。而耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的产生，使结核病防治形势更加严峻[2]。MDR-TB即至少同时对异烟肼(INH)和利福平(RFP)产生耐药的结核病[3]，其治疗成本高、周期长、治愈率低，早诊断、早治疗是实现耐药结核病有效防控的关键所在[4-6]。目前，常用的结核分枝杆菌药物敏感性试验(简称“药敏试验”)普遍存在耗时长、操作复杂、标准难以统一等缺点；因此，无论临床还是疾控领域都迫切需要一种快速而准确的结核分枝杆菌耐药检测方法[4-8]。本研究应用探针荧光PCR熔解曲线法进行结核分枝杆菌DNA鉴定和INH、RFP耐药突变的快速检测，并与传统的BACTEC MGIT 960(简称“MGIT 960”)液体培养和液体药敏试验结果相比较，以评价该方法在快速诊断结核病和MDR-TB中的应用价值，并为相关研究提供理论基础。

材料和方法

一、 标本来源

收集2015年9月至2016年12月新疆维吾尔自治区胸科医院976例疑似结核病住院患者的痰液标本。

二、 试剂与仪器

RFP、INH购于美国Sigma-Aldrich公司； MGIT 960液体培养设备及培养管购于美国BD公司；4% NaOH由购于国药集团的分析纯氢氧化钠粉末以双蒸水自行配制；Lab-Aid 824全自动核酸提取仪及配套结核分枝杆菌核酸提取Maxi试剂购于厦门致善生物科技股份有限公司；Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪购于美国伯乐公司。

三、 液体培养与药敏试验

按照中国防痨协会《结核病诊断实验室检验规程》进行MGIT 960液体培养(以下简称：液体培养)。用移液枪吸取2～5 ml痰液至50 ml离心管中，加入1～2倍体积的4% NaOH溶液，振荡15～30 s，直至痰标本充分液化；……