慢性丙型肝炎和肝硬化患者外周血Th17和Treg细胞及其相关细胞因子水平变化*

周思思，沈有秀，李娟，俞科贤

据报道，70%～80%HCV感染会发展为慢性肝病，其中约20%可进展为肝硬化（liver cirrhosis，LC），甚至肝癌[1]。辅助性T淋巴细胞17（ helper T lymphocytes 17，Th17） 和调节性 T淋巴细胞（regulatory T lymphocytes，Treg）是新型 T 淋巴细胞亚群，具有促炎和抗炎的双重能力[2]。相关研究发现，Th17/Treg细胞比值失衡和细胞分子水平异常可促使肝炎病毒感染向慢性化发展，加重肝组织免疫炎症反应[3]。本研究检测了慢性丙型肝炎（CHC）和丙型肝炎肝硬化患者外周血Th17和Treg细胞及其相关细胞因子水平，以探讨它们变化的临床意义，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年10月～2016年10月本院收治的CHC患者33例，男17例，女16例；年龄16～50岁，平均年龄（36.35±4.28）岁。丙型肝炎肝硬化患者27例，男13例，女14例；年龄26～61岁，平均年龄（46.82±6.32）岁。符合慢性丙型肝炎防治指南的诊断标准[4]，经影像学检查诊断LC，Child-Pugh评分≥7分。排除乙型肝炎、酒精性肝病、脂肪性肝病、恶性肿瘤、精神病史和合并HIV感染患者。另选同期在本院健康体检者30例作为对照组，男16例，女14例；年龄17～63岁，平均年龄（45.91±6.23）岁。受试者签署知情同意书，本研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 治疗方法 对CHC患者，给予α-干扰素联合利巴韦林（PR）治疗方案，即给予聚乙二醇干扰素α-2a（派罗欣，上海罗氏制药有限公司，国药准字J20120075）180 μg皮下注射，1 次 /w，利巴韦林（江西汇仁药业股份有限公司，国药准字H20033538）300 mg口服，3次/d。治疗12 m，根据《丙型肝炎防治指南》（2004版）的药物应用指导原则调整剂量和治疗疗程。

1.3 外周血Th17和Treg细胞及其细胞因子水平检测 清晨，采集空腹静脉血10 mL，采用ELISA法检测白介素 -6（interleukin-6，IL-6）、IL-10、IL-17和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β，美国Market公司）；使用美国Beckman公司提供的流式细胞仪及其检测Th17和CD4+CD25+Foxp3+Treg一步法试剂盒检测血Th17和Treg细胞数。

1.4 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件处理数据，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，两两均数的比较采用LSD-t检验。计数资料以（%）表示，采用x2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组外周血Th17和Treg细胞数比较 LC和CHC患者外周血Th17和Treg细胞比率和Th17/Treg比值显著高于健康人，差异有统计学意义（P<0.05）；LC患者外周血Th17和Treg细胞比率和Th17/Treg比值显著高于CHC患者，差异有统计学意义（P<0.05，表1）。

表1 三组外周血Th17和Treg细胞（±s）比较

表1 三组外周血Th17和Treg细胞（±s）比较

与健康人比，①P<0.05；与CHC患者比，②P<0.05

例数 Th17细胞（%） Treg细胞（%） Th17/Treg比值健康人 30 2.3±0.4 1.7±0.4 1.4±0.2 CHC 33 4.6±0.7① 2.7±0.5① 1.6±0.4①LC 27 5.8±0.9①② 3.1±0.6①② 1.9±0.5①②

2.2 三组血清细胞因子水平比较 LC和CHC患者血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平均显著高于健康人，差异有统计学意义（P<0.05）；LC患者血清IL-6、IL-10、IL-17和 TGF-β 水平显著高于 CHC患者，差异有统计学意义（P<0.05，表2）。

表2 三组血清细胞因子水平（ng/L，±s）比较

表2 三组血清细胞因子水平（ng/L，±s）比较

与健康人比，①P<0.05；与CHC患者比，②P<0.05

例数 IL-6 IL-10 IL-17 TGF-β健康人 30 6.7±1.1 14.2±2.9 5.3±0.6 4.3±1.0 CHC 33 9.9±2.5① 18.0±3.2① 15.3±2.8① 5.5±0.8①LC 27 14.1±3.0①② 21.4±4.0①② 23.3±3.9①② 7.2±1.2①②

2.3 CHC患者治疗前后外周血Th17和Treg细胞比率及血清细胞因子水平变化的比较 治疗后，CHC患者外周血Th17和Treg细胞比率及血清TGF-β、IL-10和IL-17水平均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05，表3）。

表3 CHC患者外周血Th17和Treg细胞比率及血清细胞因子水平（±s）比较

表3 CHC患者外周血Th17和Treg细胞比率及血清细胞因子水平（±s）比较

例数 Th17细胞（%） Treg细胞（%） TGF-β（ng/L） IL-10（ng/L） IL-17（ng/L）治疗前 33 4.6±0.7 2.7±0.5 5.5±0.8 18.0±3.2 15.3±2.8治疗后 33 3.4±0.6 1.9±0.4 4.7±0.6 15.1±2.5 11.5±2.1 t值 - 7.477 7.177 4.596 4.102 6.237 P值 - <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

3 讨论

目前，Th细胞亚群及其相关细胞因子失衡被认为是肝炎病毒感染的主要致病机制，尤其是CD4+T淋巴细胞Th1/Th2细胞失衡方面[5，6]。另有资料显示，CD4+T淋巴细胞能够产生影响Th17和Treg细胞分化的细胞因子[7]。Th17是新近发现的T细胞亚群，可分泌IL-17、IL-6、IL-22等细胞因子，进而介导炎症反应，在自身免疫疾病和机体防御方面意义重大。而Treg作为新型T细胞亚群，可分泌IL-10和TGF-β等细胞因子，调节机体免疫耐受，控制自身免疫反应[8，9]。研究表明，Th17和Treg细胞均可能参与了肝炎病毒感染的进程，并起到重要的作用[10]。

在HCV感染后，机体肝实质细胞会产生并大量释放胸腺基质淋巴细胞生成素，进而刺激Th17细胞增值和分化，而Th17细胞可分泌IL-17并对肝细胞凋亡形成抑制，促使HCV感染细胞存活，从而造成HCV感染慢性化发展[11-13]。此外，Treg细胞增多可有助于HCV清除，抑制肝纤维化进展[14]，但它还可协同多种细胞因子如TGF-β和IL-10等作用，诱导HCV感染慢性化[15]。研究表明，CHC患者外周血Th17/Treg细胞比例较健康人高，在抗病毒治疗后Th17/Treg比例则显著降低，推测Th17/Treg细胞比值在感染慢性化进程中可能出现了动态变化[16]。本研究显示，CHC组和LC组外周血Th17、Treg细胞比率和Th17/Treg比值均显著较对照组高，LC组显著高于CHC组，差异有统计学意义，有关研究结果[17]相似，提示Th17和Treg细胞在CHC发生发展过程中增加明显，造成Th17/Treg细胞平衡紊乱，进而加速CHC病情的进展。在相关细胞因子方面，研究表明，IL-17、TGF-β和IL-10水平升高可能是产生肝硬化的重要因素[18]。IL-17可对肝星状细胞形成起促进作用，在TGF-β的直接作用下，加快肝星状细胞对细胞外基质的合成速度，引起肝纤维化，而IL-10虽可抑制炎症反应，但可促使TGF-β合成，进而加重肝纤维化。另有研究表明，血清IL-6水平与肝纤维化关系密切，相关分析显示IL-6水平与肝炎严重程度存在正相关关系[19]，说明细胞因子水平对病毒感染的进展起作用。有资料显示，IL-17、TGF-β和IL-10等细胞因子水平升高可加速Treg细胞分化，促使丙型肝炎病毒向慢性丙型肝炎发展[20]。健康人血清细胞因子水平最低，而CHC组和LC组则升高，且Th17、Treg细胞比率和各细胞因子水平与肝功能指标存在正相关关系[21]。本研究发现，LC组和CHC组血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平均显著高于对照组，LC组血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平又显著高于CHC组，差异有统计学意义，提示Th17、Treg细胞和血清细胞因子水平与CHC或LC发生发展存在一定的关系。Th17细胞可分泌IL-17，可直接作用于肝星状细胞表面的IL-17R，进而激活肝星状细胞，分泌更多IL-6，并促使 TGF-β、TGF-α 水平升高[22]，而 Treg细胞分泌的IL-10可形成对中性粒细胞的负性调节，降低对肝细胞的损害，但可抑制HCV特异性T细胞增殖及细胞因子的分泌，其与Th17细胞的分化作用相互排斥[23-25]。故当Th17/Treg比值升高，Th17细胞比率高于Treg细胞时，可反映HCV感染的慢性化进展。此外，有关研究发现，病毒性肝炎患者经抗病毒治疗后Treg细胞、Th17细胞和血清IL-17、TGF-β、IL-10和IL-23水平均比治疗前显著降低[26]。本研究数据显示，CHC患者经抗病毒治疗后外周血Th17、Treg细胞比率和血清TGF-β、IL-10和IL-17水平均显著低于治疗前，差异有统计学意义，进一步说明外周血Th17和Treg细胞及其相关细胞因子水平可反映CHC患者病情变化，或许对新治疗靶点的探寻以及治疗效果的判断具有一定的临床指导意义。

本研究病例数较少，观察时间较短，且为单中心观察，未对接受抗病毒治疗的CHC患者进行不同应答分层比较，故还有待于进一步大样本的随访观察。