let-7a调控自噬对缺氧状态下原发性肝癌HCCLM3细胞增殖的影响*

佟辉，李涛，申川，彭承宏，邱伟华，沈柏用，祝哲诚

肝癌组织在体内往往处于过度增生状态。由于癌细胞无限增殖，导致肝癌组织血管过度增生。肝癌组织高强度的生理活动耗氧明显，使细胞局部微环境处于缺氧状态。然而，肝癌细胞并没有因为缺氧而发生一系列的细胞凋亡，仍具有旺盛的增生活力。细胞自噬是在缺血缺氧状态下发生的自我吞噬内部成分物质的分解代谢过程。通过自噬泡包裹细胞内受损、衰老的蛋白质和细胞器，运输到溶酶体，水解成氨基酸，被细胞重新利用[1，2]。适度的细胞自噬可使细胞避开不良生长环境，获得生命必须物质。自噬的分子调控机制复杂，目前尚未明确。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类 22个核甘酸左右的高度进化保守性的非编码单链小RNA，能结合信使RNA的3'端非翻译区，调控转录水平后的基因翻译。miRNA参与了胚胎发育、细胞增殖和分化、免疫、病毒感染等一系列生命活动。此外，miRNA与肿瘤的发生、发展、细胞凋亡也有着密切的联系[3]。作为miRNA家族的一员，let-7a可调控多种肿瘤细胞多种癌基因信号通路，在调控肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭等方面也有重要的作用，对肿瘤组织有明显的抑制作用。let-7a与cyc D1和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 关系密切，参与对细胞周期G1期的调控[4]。然而，在缺氧状态下let-7a对原发性肝癌细胞自噬和细胞增殖的影响还未见有报道。本研究建立了缺氧型原发性肝癌HCCLM3细胞模型，探讨了let-7a调控细胞自噬对细胞增殖的影响，为原发性肝癌的发生和发展机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源、仪器与试剂 HCCLM3细胞（中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库）、DnJ-4249CO2培养箱（美国REVCO公司）、DMEM培养基（赛默飞世尔科技中国有限公司）、胰酶（美国Gibco公司）、四甲基偶氮唑蓝（北京广源恒信科技发展有限）、胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司）、let-7a-mimics（上海伯豪生物技术有限公司）、吖啶橙（碧云天生物技术公司）、细胞周期测试试剂盒（碧云天生物技术公司）、检测let-7a、cyc D1蛋白和VEGF蛋白的ELISA试剂盒（南京诺尔曼生物技术有限公司）、DMI3000 B倒置显微镜（德国LEICA公司）、MK3酶标仪（美国 Thermo公司）、恒温培养箱grp-9080（美国通用公司）、二氧化碳培养箱（赛默飞世尔科技中国有限公司）、超净工作台（上海恒跃医疗器械有限公司）。

1.2 HCCLM3细胞复苏培养及其分组设计 将装有HCCLM3细胞株的冻存管从液氮中取出，在37℃水浴箱中迅速解冻，无菌吸管吸取菌液加入5 ml EPP无菌管中，1500 r/m离心5 min，吸弃上清液，加入pH值为7.2、含10%胎牛血清、链霉素100 μg/ml、青霉素 100 μg/mL的 RPMI-1640培养基，直至 5 ml，37℃、5%CO2培养箱中培养，3 d 换液。当细胞融合率达到80%时，用0.5%胰蛋白酶消化、传代。分组设计:常氧组：取HCCLM3细胞悬液（细胞数为5×106/ml）10 ml，于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，置于 CO2培养箱（37℃、5%CO2、20%O2）；缺氧组：取 HCCLM3细胞液（细胞数为5×106/mL）10 mL于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于 CO2培养箱（37℃、5%CO2、2%O2、93%N2）；缺氧let-7a组：取转染let-7a-mimics的HCCLM3细胞液（细胞数为5×106/ml）10 ml于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于CO2培养箱（37℃、5%CO2、2%O2、93%N2）。以上各组每孔设 6个平行孔，培养72 h。

1.3 let-7a-mimics转染HCCLM3细胞 取HCCLM3细胞悬液（细胞数为5×106/ml）11 ml，接种于6孔板。取100 pmol的miRNA于200 μl DMEM培养基中，取 lipofectamine2000 4 μl，于 200 μl DMEM 培养基中，混匀，室温培育30 min，无菌PBS洗涤细胞，将混合液加入细胞孔内，6 h后弃混合液，加入含有胎牛血清的DMEM培养基培养。

1.4 HCCLM3细胞自噬测定 于各组HCCLM3细胞培养结束前0.5 h，在细胞培养液中加入吖啶橙染液（1μg/ml），常温染色30 min，无菌PBS洗涤清洗,于倒置荧光显微镜下观察细胞染色变化。细胞质内出现酸性自噬小体（红色），说明细胞发生自噬，为阳性细胞；细胞质内出现绿色荧光，说明细胞未发生自噬，为阴性细胞。于高倍镜下随机计数200个细胞，并计算阳性细胞比率。

1.5 HCCLM3细胞增殖活力检测 采用MTT法，在染毒结束后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml）10 μl，37℃继续孵育4 h，每孔加入OMSO 150 μl，在酶标仪于490 nm波长处测定吸光度（A）值，计算细胞存活率[细胞存活率=（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）]。

1.6 HCCLM3细胞周期和自噬率测定 各组细胞于转染后72 h用胰酶消化,用无菌PBS液清洗,加入70%乙醇重悬细胞，4℃冰箱过夜。次日，加入RNA酶溶液，室温30 min，加入碘化丙啶0.8 mL，30 min后上流式细胞仪检测分析。

1.7 HCCLM3 细胞培养上清液 let-7a、cyc D1、VEGF水平测定 在染毒结束后，5000 r/m离心，收集各组细胞，加入PBS制成细胞悬液，3000 r/m离心,收集上清液，采用酶联免疫吸附法测定。

1.8 统计学方法 应用Epidata和SPSS 19.0软件录入数据和统计学分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料采用x2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HCCLM3细胞增殖情况比较 缺氧组细胞存活率显著高于常氧组，差异有统计学意义（t=9.40，P<0.05）；缺氧let-7a组细胞存活率显著高于常氧组或缺氧组，差异有统计学意义（t=10.34，t=11.34，P<0.05，表1）。

2.2 各组HCCLM3细胞周期G1期和细胞自噬情况比较 缺氧组细胞周期G1期低于常氧组，自噬率高于常氧组，差异有统计学意义（t=16.78、t=18.60，P<0.05）；缺氧let-7a组细胞周期G1期高于常氧组或缺氧组，自噬率低于常氧组或缺氧组，差异有统计学意义（t=15.34、t=16.25、t=13.78、t=18.34，P<0.05，表2）。

表2 各组HCCLM3细胞周期G1期和细胞自噬率（%）比较

2.3 各组HCCLM3细胞上清let-7a、cyc D1和VEGF水平比较 缺氧组let-7a蛋白水平低于常氧组，而cyc D1和VEGF水平高于常氧组，差异有统计学意义（t=19.65、t=17.34、t=18.26，P<0.05）；缺氧 let-7a组let-7a高于常氧组或缺氧组，而cyc D1和VEGF低于常氧组或缺氧组，差异有统计学意义（t=16.78、t=17.90、t=21.33、t=19.43、t=17.34、t=22.54，P<0.05，表3）。

表3 各组HCCLM3细胞上清蛋白水平(μmol/L，±s)比较

表3 各组HCCLM3细胞上清蛋白水平(μmol/L，±s)比较

与常氧组比，①P<0.05；与缺氧组比，②P<0.05

孔数 let-7a蛋白常氧 6 65.3±5.2缺氧 6 33.4±7.1①缺氧 let-7a 6 96.1±9.3①②cyc D1蛋白98.2±6.7 124.1±7.2①72.3±8.8①②VEGF 85.2±8.1 114.1±5.2①56.3±6.3①②

3 讨论

作为高度进化保守性的非编码小 RNA，let-7a mi RNA在调控肿瘤发生、发展过程中有重要作用，在调控细胞的基因表达方面也扮演重要角色。经典的mi RNA调控路径是与靶m RNA的3’端非编码区特异性结合，抑制mRNA的翻译[5-7]。此外，let-7a还可与靶mRNA的5’端结合，发挥转录后抑制作用。let-7a作用于Dicer酶mRNA的5’端，直接抑制Dicer酶[8-10]；对3’端非编码区的多聚腺苷酸的脱腺苷化在let-7转录后调控靶mRNA过程中也具有一定的作用，但这种作用还不是转录后调控的主要机制[12-15]。

细胞自噬是高等脊椎动物细胞内一种利用溶酶体对细胞器进行降解的生物学过程。细胞自噬与生物体生长发育、细胞分化和对环境的应答密切相关，也与生物体各种病理、生理活动关系密切[16-18]。

本研究结果表明，HCCLM3细胞在缺氧环境下，细胞内let-7a表达明显下降，细胞自噬率明显低于常氧下的表现，细胞增殖也明显增高。在缺环环境下，通过转染let-7a-mimics，细胞内let-7a表达明显升高，甚至高于缺氧环境下let-7a的表达，而细胞自噬率也明显升高，达到最高水平，进而细胞增殖受到抑制，结果说明通过上调let-7a在肝癌HCCLM3细胞的表达，能诱发细胞自噬，抑制细胞在缺氧环境中的增殖。

本研究结果显示，上调let-7a在肝癌HCCLM3细胞的表达，肝癌HCCLM3细胞处于G1期的比例明显增多，使得细胞在G1期往S期的分化发生障碍。CYC D1和VEGF均是调节细胞生长、增殖的重要调节因子，上调let-7a在肝癌HCCLM3细胞的表达，结果使得CYC D1和VEGF表达明显下降[19，20]。

综上所述，上调let-7a在肝癌HCCLM3细胞的表达，能诱发细胞自噬，使得细胞停滞在在G1期增多，抑制细胞在缺氧环境中的增殖活动，其机制可能与CYC D1和VEGF表达下调有关。