新色谱条件下家酿葡萄酒发酵时间对甲醇含量的影响

◎ 周永青，梁天然，钱 臣，唐 琪，谢益群

（当涂县市场监督检验所，安徽 当涂 243100）

葡萄酒是一种广泛饮用的低酒精消费饮料，有着显著的商业价值和社会价值。随着人们生活水平的提高，葡萄酒已成为越来越受欢迎的饮品，其产量逐年上升，品种不断增加，市场日益繁荣。葡萄酒受到越来越多的人喜爱，因为其具有很高的营养价值和保健作用，同时具有调节新陈代谢、促进血液循环、防止胆固醇增加、激发肝功能和防止衰老的作用。随着人们生活水平逐步提高，人们对葡萄酒质量和品质要求随之提高。自酿葡萄酒没有添加任何有害物质，靠葡萄皮表面上携带的酵母菌自然发酵而成，因其酿造方式经济方便，越来越成为一种生活方式而被人们接受。但自酿葡萄酒成分复杂，除水、乙醇、糖、蛋白质、果胶、有机酸和微量元素外，还存在有毒有害的甲醇[1]。甲醇主要危害人体的神经系统，对视神经及视网膜有特殊选择作用，严重时会导致双目失明。甲醇主要来源于葡萄原料中果胶质的酶解，葡萄在除梗破碎过程中，存在于葡萄的皮与籽内的大量果胶被果胶甲酯酶水解，生成甲醇。根据国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）的标准Oeno19/2004《葡萄酒中不同物质的最大检出值》以及我国国家标准GB/T 15037-2006[2]，红葡萄酒与白、桃红葡萄酒中的甲醇含量上限分别是400 mg/L和250 mg/L，甲醇含量低于标准的葡萄酒方可食用。

20世纪70年代以来，由于分析技术的进步，特别是气相色谱分析在白酒工业中的应用，推动了整个酿酒生产技术的发展，促进了发酵酒质量的提高。气相色谱分析法是一种先进新型的分离分析技术，它具有选择性高、分离效能高，速度快，灵度高，样品用量少且应用范围广的特点，已广泛应用于酿酒行业，其既能准确地分析葡萄酒中甲醇、醇油等控制性组分，又能对仅占葡萄酒6%香味成分进行单一组分分离，得出各组分的含量，明确表示出各香味成分之间的量比关系，为品质的稳定和提高提供必不可少的技术支持[3]。

本文将采用常用手工酿造技术，结合实际实验条件，手工酿制葡萄酒，并对现行国家标准检验方法进行优化改进。在实验过程中，设计了单因素实验和正交实验，优化色谱测定因素，考察气化室温度、柱温、载气流量、检测器温度、氢气流量等因素对各成分分离分析的影响，为葡萄酒中各组分的测定提供更为优化得分析方法，同时测试发酵时间对葡萄酒中甲醇含量的影响。

1 实验部分

1.1 葡萄酒的酿制

1.1.1 酿造材料

容量20 L的带盖玻璃罐，当地产红皮葡萄（马鞍山市当涂县大陇乡），白糖。

1.1.2 酿造方法

选取质量较好的葡萄，清洗晾干，手工除梗破碎，注意保存葡萄籽的完整性，搅拌均匀后，装在玻璃罐中，按葡萄和白糖10∶3的比例添加白糖，利用葡萄自带酵母菌自然发酵，密封保存。保持发酵温度在20～25 ℃。期间经常震荡摇晃，让葡萄皮沉淀下去，色素渗出。自然发酵14 d左右，发酵速度逐渐转为平缓，葡萄皮浮在表面，颜色由深变浅，葡萄籽和大部分果肉残渣沉入罐底。用灭菌纱布进行过滤，装罐，再次发酵。第2次发酵时间约为1周，此时酒液已澄清，不再产生气泡，将上清液倒出，保存于另一玻璃罐中室温保存[4]。

1.2 检测仪器和试剂

仪器：岛津气相色谱仪GC2010Plus，配有氢火焰离子化检测器（载气氮气，燃烧气氢气，助燃气空气）；毛细管柱，白酒分析专用柱，长度30.0 m，内径0.32 mm，膜厚1 μm。

1.3 试剂耗材

白酒色谱成分分析标准物质GBE（E）100012（混标）、GBE（E）100013（内标），贵州省计量测试院；超纯水；甲醇，色谱纯；无水乙醇，色谱纯。

1.4 色谱条件

初始条件依据国标GB/T 10345-2007《白酒分析方法》[5]10.4.1.1设定。

载气（高纯氮）：流速为0.5～1.0 mL/min，分流比约为37∶1，尾吹约20～30mL/min；氢气，流速为40 mL/min；空气，流速为400 mL/min；检测器温度，220 ℃；注样器温度，220 ℃；柱温，起始温度60 ℃，恒温3 min，以3.5 ℃/min程序升温至180 ℃，继续恒温10 min。进样量，1μ L。此法检测色谱图会出现明显的基线漂移，影响积分面积，进而影响数据的准确性。色谱图如图1所示。

图1 依据GB/T 10345-2007《白酒分析方法》10.4.1.1方法检测白酒混标标样图

1.5 单一条件比对实验

实验过程中，分别采取改变升温方式和速率、进样口温度、检测器温度、分流比、载气流量单一条件的方式来评价对各组分分离条件的影响。根据本实验室综合判断评比得出相对国标条件更为优化的检测条件：载气（高纯氮），流速为1.0 mL/min，分流比约为50∶1，尾吹流量30 mL/min；氢气，流速为30 mL/min；空气，流速为300 mL/min；检测器温度，230 ℃；注样器温度，230 ℃；柱温，80 ℃，恒温30 min；进样量，1 μL。色谱图，如图2所示。由图可以看出，条件优化后，基线水平，谱图峰形完美，积分面积均匀完整，各组分完美分离。

图2 依据GB/T 10345-2007《白酒分析方法》10.4.1.1方法优化后检测的白酒混标标样图

2 方法研究分析

2.1 精密度实验

依据优化后的分析方法，对白酒样品进行6次平行检测，结果见表1。由表1可知，白酒样品中的甲醇组分测定结果RSD为0.38%，表明优化后的测量精密度良好。

表1 甲醇组分精密度实验结果表

2.2 加标回收实验

将混合标液加入到已知含量的样品中，测定回收率，结果见表2。由表2可知，甲醇回收率在95.9%～96.7%。

表2 加标回收试验结果表

3 单因素比对试验

采用优化后的白酒分析方法进行家酿葡萄酒的检测后发现，该方法具有家酿葡萄酒适用性，检测谱图峰形完美，积分面积均匀完整，各组分分离充分，如图3所示。

图3 依据GB/T 10345-2007《白酒分析方法》10.4.1.1方法优化后检测的自酿葡萄酒样品图

在统一其他条件不变的情况下，对葡萄酒进行时间单一因素试验，观察其变化对葡萄酒中甲醇含量的影响，详见表3、图4。

表3 甲醇含量与发酵时间的变化关系表

由图表可知，葡萄酒发酵初期由于自身所含的果胶大量酶解，生成甲醇的速率非常快，随着果胶的大量分解代谢，甲醇的生成速冻明显平缓，并随着时间的推移而趋于稳定，最终稳定在400 mg/L左右。

图4 甲醇含量与发酵时间的变化关系图

4 结语

实验结果表明，优化后的白酒分析条件，相比于国标，不仅灵敏度高，分离效果好，色谱峰形完美匀称，而且测量结果精确度高，适用于同条件下的葡萄酒中甲醇成分分析检测。在统一其他条件不变的情况下，发酵时间对葡萄酒中甲醇的含量有一定的影响作用，随着发酵时间的推移，甲醇的生成速率呈下降趋势，最后逐步趋于稳定。本实验的结果表明，在家酿葡萄酒的过程中，若酿造条件控制得当，葡萄酒中甲醇含量可以控制在国家标准限定的范围内，可以放心饮用。