龙胆苦苷纳米乳处方优化及其质量评价

夏鹏飞 马肖 吴国泰 李阳 樊秦 赵磊

摘要：目的 筛选处方并制备龙胆苦苷纳米乳，并对其质量进行评价。方法 根据龙胆苦苷的基本性质，基于单因素试验和伪三元相图法选择纳米乳处方，对其理化性质进行考察，采用HPLC对其含量进行评价。结果 筛选得到龙胆苦苷纳米乳制剂处方为：龙胆苦苷∶乙酸乙酯∶聚氧乙烯醚（35）蓖麻油∶无水乙醇∶水=1.77∶7.66∶5.94∶11.91∶72.71；测得龙胆苦苷纳米乳平均粒径为23.08 nm；建立了HPLC测定龙胆苦苷纳米乳中龙胆苦苷含量的方法，专属性良好，线性范围为0.004 28～0.214 mg/mL；在不同温度、光照和湿度条件下含量无明显变化，稳定性良好。结论 本研究筛选的龙胆苦苷纳米乳制备工艺简单，为提高龙胆苦苷口服生物利用度提供了依据。

关键词：龙胆苦苷；纳米乳；制备工艺；质量评价

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.015

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）07-0062-05

Prescription Optimization and Evaluation of Quality of Gentiopicroside Nanoemulsion

XIA Peng-fei1，2，3， MA Xiao4， WU Guo-tai1，5， LI Yang1，2，3， FAN Qin1，2，3， ZHAO Lei1，2，3

1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines， College of Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 3. Gansu Province Engineering Laboratory for TCM Standardization Technology and Popularization， Lanzhou 730000， China； 4. Second Peoples Hospital of Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 5. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of TCM of Gansu Province， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To optimize prescription of gentiopicroside nanoemulsion； To evaluate its quality and security. Methods According to the basic properties of gentiopicroside， single-factor test and pseudo-ternary phase diagram were adopted to optimize prescription of gentiopicroside nanoemulsion. The physicochemical property was investigated， and the content was evaluated by HPLC. Results Optimal prescription was obtained as gentiopicroside/ ethyl acetate/ EL-35/ absolute ethyl alcohol/ ultrapure water （1.77：7.66：5.94：11.91：72.71）； the particle size of nanoemulsion was 23.08 nm； the content of gentiopicroside was determined by HPLC； the specificity of the method was good with a linear range of 0.004 28–0.214 mg/mL； stability of prepared gentiopicroside nanoemulsion was good in the state of different temperatures， illumination intensity and humidity conditions， without significant changes. Conclusion The optimized preparation technology of gentiopicroside nanoemulsion is simple， repeatable and stable， which can provide references for improving the bioavailability of gentiopicroside.

Keywords： gentiopicroside； nanoemulsion； preparation technology； quality evaluation

龍胆苦苷是秦艽、龙胆等龙胆科植物的主要有效成分。研究表明，龙胆苦苷具有明确的保肝利胆、抗炎镇痛活性[1]，同时还具有抗氧化、抑制肿瘤[2]、中枢兴奋、抗病原微生物及增强免疫等作用[3]，临床可应用于肝炎防治[4]。本课题组前期研究发现，龙胆苦苷对骨关节炎具有一定的治疗作用[5]。目前，含有龙胆苦苷的中药剂型以口服制剂为主[6]。龙胆苦苷为环烯醚萜类化合物，自身极性较大，极易被酸水解，所以口服后在生物体内吸收快、消除快。药代动力学实验表明，其在大鼠体内代谢的消除半衰期仅0.64 h[4]，生物利用度较低，严重影响龙胆苦苷的药效发挥和开发利用。

纳米乳包括水包油（O/W）型、油包水（W/O）型及双连续型，是由水相、油相、乳化剂和助乳化剂按适当比例组成的热力学稳定体系，能够通过将药物包裹形成粒径在10～100 nm之间的球体，达到增加难溶药物溶解度、提高易水解药物稳定性的作用，进而达到缓释、靶向及提高药物生物利用度的目的[7]，该技术已渗透到生物医药、化工、食品等领域，展现出良好的应用前景[8]。本试验旨在筛选适宜的油相、乳化剂及助乳化剂，制备龙胆苦苷纳米乳，以期凭借纳米乳的特性，研制一种能够提高龙胆苦苷稳定性、疗效及生物利用度的纳米乳制剂，并对其含量、黏度、密度、折光率、粒径、稳定性等参数进行测定，以评价和控制纳米乳制剂的质量。

1 仪器与试药

Tecnai G2 20型分析透射电镜，美国FEI公司；Zetasizenano 3600激光纳米粒度仪，英国马尔文公司；JJ-3控温磁力搅拌器，金坛市恒丰仪器厂；SW22恒温水域振荡器，优莱博技术（北京）有限公司；PBJ 420-3M电子分析天平，德国科恩公司；UW620H电子分析天平，日本岛津公司；Agilent 1260II Infinity高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。

龙胆苦苷（批号20160308），天津士兰科技有限公司；聚氧乙烯醚（35）蓖麻油（EL-35）、肉豆蔻酸异丙酯（IPM）、聚氧乙烯醚（40）蓖麻油（EL-40）、聚氧乙烯醚（40）氢化蓖麻油（RH40）均为化学纯，江苏省海安石油化工厂；司盘-80、乳化剂OP-10（莱阳市双双化工有限公司），乙酸乙酯、无水乙醇、吐温- 80（天津市大茂化学试剂厂），液体石蜡（天津欧博凯化工有限公司），大豆卵磷脂（天津市凯信化学工业有限公司），丙三醇（国药集团化学试剂有限公司），均为分析纯。液相色谱用试剂为色谱纯，水为超纯水（本实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 处方筛选

2.1.1 伪三元相图的绘制

将乳化剂与助乳化剂按一定质量比（Km）混匀形成混合乳化剂，再与油相按Km分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混匀，在磁力搅拌情况下逐滴加入超纯水，观察混合体系的变化，滴定过程中可借助丁达尔现象和偏光显微镜来判断是否形成了纳米乳，最终记录体系由浑浊变为澄清时的临界加水量。采用OriginPro8.5软件，以水相、油相及混合乳化剂质量为3个顶点，绘制伪三元相图[9]，以伪三元相图中纳米乳区域面积的大小作为筛选各相的依据。

2.1.2 水相和油相的选择

龙胆苦苷极性较大，在水中具有良好的溶解性，溶解度达7.65 g/100 g[10]，因此，选择超纯水为水相，选取乙酸乙酯、IPM、液体石蜡、橄榄油及棕榈酸异丙酯为待选油相，测定龙胆苦苷在各油相中的溶解度，最终选择对龙胆苦苷溶解能力较大的乙酸乙酯为油相。

2.1.3 乳化剂和助乳化剂的筛选

乳化剂的选择要考虑到纳米乳本身及其使用目的、经济性、安全性等问题，是筛选纳米乳处方组分最重要的一步。本研究选择OP-10乳化剂、RH-40、吐温-80、EL-35及EL-40为待选乳化剂。根据乳化理论和纳米乳的特性，纳米乳的形成需要有助表面活性剂提供短暂的负表面张力作用。醇类为应用最广泛的助表面活性剂，不仅可以协助表面活性剂降低界面张力，增加界面流动性，调节表面活性剂的亲水疏水平衡值（HLB），还可以增大药物溶解度，增大纳米乳区域面积。因此，本研究选择无水乙醇、异丙醇、正丁醇及1，2-丙二醇为待选助乳化剂。在考察乳化剂时选择无水乙醇为助乳化剂，按“2.1.1”项下方法绘制伪三元相图，以图中纳米乳区域面积大小作为选择乳化剂及助乳化剂的依据，结果见图1、图2，最终选择EL-35为乳化剂，无水乙醇为助乳化剂。

2.1.4 乳化剂与助乳化剂比例筛选

分别将EL-35与无水乙醇按Km分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3混合，再按“2.1.1”项下方法绘制伪三元相图，以图中纳米乳区域面积大小作为选择Km值的依据，结果见图3。可以看出，Km分别为2∶1、1∶2时，伪三元相图中纳米乳区域较大，考虑到无水乙醇对纳米乳制剂的良好影响，因此选择Km=1∶2。

2.1.5 龙胆苦苷纳米乳的制备

以伪三元相图和药物稳定性为依据，龙胆苦苷纳米乳的处方组成为：龙胆苦苷∶乙酸乙酯∶EL-35∶无水乙醇∶水=1.77∶7.66∶5.94∶11.91∶72.71。按照该比值对各组分进行称取，室温下将龙胆苦苷溶于超纯水中，搅拌的同时加入乙酸乙酯、EL-35、无水乙醇，得到澄清透明的龙胆苦苷纳米乳。

2.2 理化性质考察

2.2.1 外观和类型鉴别

正常光照下观察，龙胆苦苷纳米乳为淡蓝色、澄清透明的液体，流动性良好，激光束照射呈现丁达尔效应。纳米乳类型的鉴别采用染色法[11]，根据红色的油溶性染料苏丹红Ⅲ和蓝色的水溶性染料亚甲兰在纳米乳中扩散的快慢来判断，蓝色的扩散速度大于红色则纳米乳为O/W型，反之则为W/O型，二者相同则为双连续型。结果表明，本试验研制的龙胆苦苷纳米乳为O/W型。

2.2.2 密度、黏度、折光率和pH值

采用比重瓶测定龙胆苦苷纳米乳的密度为1.009 9；采用奥氏黏度计测定龙胆苦苷纳米乳的黏度为4.443 7×10-3 Pa·s；采用阿贝折光仪测定龙胆苦苷纳米乳的折光率为1.344 8；采用酸度计测定龙胆苦苷纳米乳的pH值为6.049。

2.2.3 形态

將龙胆苦苷纳米乳滴在覆有支持膜的铜网上，静置10 min后滴加3%磷钨酸溶液于铜网上负染5 min，自然挥干，透射电镜下观察纳米乳的形态呈圆球形，分布均匀（见图4）。

2.2.4 粒径和粒度分布

取适量龙胆苦苷纳米乳，采用激光纳米粒度仪进行测定，纳米乳的粒径分布见图5。结果表明，龙胆苦苷纳米乳的粒径主要集中在10～100 nm之间，平均粒径为23.08 nm，多分散系数（PDI）为0.24。

2.3 龙胆苦苷含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Thermo ODS HYPERSIL柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（25∶75）；流速：1 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.3.2 标准曲线的建立

精密称取龙胆苦苷对照品0.010 7 g，用甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得到浓度为0.214 mg/mL的贮备液，于4 ℃保存。精密吸取贮备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.7、5.0 mL，分别置于5 mL量瓶中，用甲醇定容，得龙胆苦苷系列浓度溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积对龙胆苦苷浓度进行线性回归，得标准曲线回归方程Y=12 053X+6.111（r2=1），表明龙胆苦苷在0.004 28～0.214 mg/mL范围内有良好的线性关系。

2.3.3 供试品溶液的制备

精密称取样品适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声30 min破乳，静置10 min，取续滤液，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得。

2.3.4 专属性考察

取龙胆苦苷对照品溶液、空白纳米乳、龙胆苦苷纳米乳按，“2.3.1”项下色谱条件进行测定，色谱图见图6。可见，龙胆苦苷色谱峰无干扰，峰形良好。

2.3.5 方法学考察

重复性试验，稳定性试验，日间、日内精密度试验RSD均小于3%，加样回收率为99.4%。

2.4 稳定性考察

龙胆苦苷纳米乳10 000 r/min离心10 min，仍保持澄清透明，未出现分层、沉淀；室温密封放置90 d，仍保持澄清透明，无分层、药物析出现象；将龙胆苦苷纳米乳置于高温（40 ℃）、低温（4 ℃）及光照（4500±500）Lx、相对湿度92.5%条件下，分别于0、3、7 d取样进行含量测定，结果见表1。可见，龙胆苦苷纳米乳在上述条件下含量、性质保持稳定。

3 讨论

纳米乳是超微米大小的胶体微粒系统，可以增强药物的生物利用度，提高药物的治疗效果及物理稳定性，提高亲脂性药物的溶解性，掩盖原料药苦味，可制成多种多样的剂型，用于注射给药、黏膜给药、口服给药及经皮给药，扩大药物的使用范围。

本试验基于单因素法结合伪三元相图法对纳米乳的处方进行筛选优化，得到了龙胆苦苷纳米乳的最佳处方，同时使处方中油相、乳化剂及助乳化剂的比例降至最低，以减少其对机体的影响；通过考察纳米乳的理化性质，保证制剂工艺的合理；通过建立含量测定的方法，对纳米乳的质量进行控制；通过测定稳定性，保证纳米乳制剂在非正常状态下仍能保持性质、含量的稳定。

龙胆苦苷具有明显抗炎镇痛作用[12-13]，因良好的活性展现出巨大的潜在优势。但其极性较大，口服后吸收快、消除快，导致生物利用度较低。将龙胆苦苷制成纳米乳制剂可减小极性，提高放置稳定性，借助纳米乳形成包裹物减慢其在体内的吸收、代谢速度。

龙胆苦苷在水中具有良好的溶解度，使龙胆苦苷纳米乳的载药量得到了保障。选择乙酸乙酯为油相，广泛应用于医药产业；选择EL-35为乳化剂，所得伪三元相图纳米乳区域较大，能满足作为药物原料时的临床要求；醇类是常用的助乳化剂，能增大药物溶解度，提高载药量，通过自身的剪切作用减小纳米乳的粒径，最终选择无水乙醇为助乳化剂。本研究制备的龙胆苦苷纳米乳为O/W型纳米乳，可用大量水进行稀释，自由调节浓度，使用方便，并且可开发成其他剂型，扩大适用范围。本研究结果可为提升龙胆苦苷口服生物利用度及扩大临床应用提供参考依据。

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（收稿日期：2017-06-13）

（修回日期：2017-09-14；编辑：陈静）