海仁藻酸致痫对老年大鼠脑NMDA亚单位R1蛋白表达的影响

赵吉波 房艳宇 王 澍 刘宏斌

(齐齐哈尔医学院附属三院神经内科，黑龙江 齐齐哈尔 161000)

癫痫也称羊癫疯，属于慢性疾病，是大脑神经元突发性异常放电，最终导致大脑功能障碍〔1〕。据不完全统计，我国癫痫年发病率约为0.028 8%，1年内发作的活动性癫痫发病率约为4.25%〔2，3〕。其临床表现复杂多样，可表现为自主神经、精神障碍。迄今为止，其发病机制尚不清楚，增加了癫痫的临床诊断及治疗难度。已有学者指出〔4〕，N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)亚单位的构成及其功能对于选择抗癫痫药物、减少不良反应有较大作用。本文进一步探讨海仁藻酸致痫对老年大鼠脑NMDA亚单位R1蛋白表达的影响。

1 资料和方法

1.1一般资料 选取36只成年(24月龄)无特定病原体的雄性大鼠，体重240～320 g，平均(278.21±12.52)g。大鼠饲养及其取材均严格遵守动物管理及保护的相关规定。实验动物购买后，实验室内饲养6 w，随机分为6组各6只，对照组平均体重(274.25±12.85)g；假手术组(280.25±14.25)g；海仁藻酸致痫2 h组(279.55±12.43)g；海仁藻酸致痫6 h组(280.58±11.47)g，海仁藻酸致痫24 h组(278.85±11.85)g，各组体重差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器及试剂 仪器：日本奥林巴斯公司提供的正置焚光显微镜、图像分析系统；美国MDS公司提供的多功能酶标仪；英国SHANDON公司提供的AS325轮转式切片机；Leica公司提供的石蜡包埋机、小型髙速离心机；青岛海尔集团提供4℃冰箱；苏净集团安泰公司提供的SW-CJ-IF超净台、40×45型电热恒温干燥箱、高速离心机；calibrate beads公司提供的流式细胞仪；BAYGENE公司提供的脱色摇床、电泳仪。试剂：Life Technologies提供的生理盐水；自行配制乙醇、磷酸盐缓冲液(PBS)、4%中性多聚甲酵固定液、Tris缓冲液。

1.3模型制备 采用10% 0.33 ml/kg水合氯醛麻醉后，于立体定位仪下，将海仁藻酸注入右侧杏仁核中，制备癫痫模型。采用5 μl注射器垂直注入杏仁核，将其作为对照组。假手术组：注入1 μl生理盐水。其他3组则分别按照1 ml/min的速度注入1 μl海仁藻酸，注射完后，留针5 min，缓慢退出。

1.4灌注取材 采用水合氯醛腹腔麻醉后，大鼠仰卧，并对其进行固定；剖开腹腔，充分暴露心脏；将穿刺针从左心室刺入升主动脉，将右心耳剪开；采用200 ml生理盐水快速灌注，再将250 ml 4% 多聚甲醛灌入；后剖开大鼠大脑，取出脑组织；将其置入灌注液中2 h，经过二甲苯、进腊等完成脱水处理；最后采用石蜡包埋；采用轮转式切片机连续切片蜡块，每一个切片厚度约8 μm，以备病理改变观察。

1.5免疫组化 首先，进行石蜡切片脱蜡，经过100%、95%、85%、75%、50%乙醇及水各1次，5 min/次，采用PBS清洗5 min，3次；其次，置于微波炉中高火且加热到沸腾，并维持加热到8 min，待水温降到室温；再次，10%正常山羊血清室温湿盒予以封闭30 min，采用PBS清洗5 min，3次，后进行二氨基联苯胺(DAB)显色、水洗等操作；最后，制作成中性树胶封片，采用自动化图像分析系统Image-ProPlus Version6.0定量分析免疫组化片的NMDA亚单位R1蛋白，每个切片随机选取4个高倍镜视野，对累积光密度值、扫描面积等进行计算，其强度用平均光密度值代表阳性。

1.6流式细胞仪检测 采用上述老年大鼠脑组织制备脑组织单细胞悬液，采用70%冷乙醇加以固定；采用PBS反复洗涤2次；每1份加入50 μl第一抗体，置于4℃冰箱内，反应45 min；然后采用PBS代替一抗，加入二抗，完成洗涤后；最后采用流式细胞仪检测。

1.7统计学分析 采用PEMS3.1软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组NMDA R1阳性细胞数密度值比较 海仁藻酸致痫4组NMDA R1阳性细胞数密度值均显著高于对照组、假手术组(P<0.05)，且海仁藻酸致痫6 h组数值达到顶峰，随后保持稳定。海仁藻酸致痫4组差异无统计学意义(P>0.05)；对照组、假手术组差异无统计学意义(P>0.05)。海仁藻酸致痫4组海马CA3、DG区NMDA R1阳性细胞数密度值均显著高于颞叶皮层，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组NMDA R1阳性细胞数密度值比较

与对照组及假手术组比较：1)P<0.05；与本组颞叶皮层比较：2)P<0.05；下表同

2.2各组NMDA R1蛋白表达水平比较 海仁藻酸致痫2 h、6 h、12 h、24 h组海马、颞叶皮层区NMDA R1蛋白表达水平均显著高于对照组、假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。海仁藻酸致痫6 h组达到高峰，随后保持稳定，见表2。

表2 各组NMDA R1蛋白表达水平比较

3 讨 论

癫痫是一种很常见的慢性神经系统疾病，由多种原因导致的神经细胞异常放电而引起的感觉、意识、行为、自主神经不同程度障碍，可反复发作〔5，6〕。癫痫的发病率较高，可发生于各年龄阶段。癫痫通常采取药物治疗，大多数癫痫患者均可以通过药物治疗达到缓解癫痫症状的目的，但还有少部分患者药物治疗反应差，此类癫痫可称为难治性癫痫〔7，8〕。难治性癫痫通过规范化药物治疗后仍无法有效控制癫痫症状，即使以后采用更多种抗癫痫药物治疗，癫痫症状得到缓解的概率仍然很低。

NMDA分布于中枢神经系统较为明显的区域，且具有特异性，在海马及前脑皮层区的密度较高〔9〕。NMDA较为重要的功能单位为NMDA R1亚单位，是由920个氨基酸组成，长度达4 213 bp，可对NMDA R1功能起到调节及修饰作用〔10〕。有研究表明〔11〕，NMDA R1基因紊乱可影响机体内蛋白质的变化，且在癫痫大鼠内NMDA R1表达水平在致癫痫后6 h达到高峰，NMDA R1蛋白可能参与到癫痫发作及发展中。海仁藻酸可通过膜电位削弱Mg2+对NMDA的作用，从而激发性激活NMDA，引起细胞内Ca2+的释放。本研究结果与相关文献研究报道一致〔12，13〕。

综上，海仁藻酸致痫老年大鼠脑NMDA亚单位R1蛋白在癫痫发作及发展中有重要作用，且随着癫痫发作时间的延长，脑NMDA亚单位R1蛋白水平也随之升高，可作为癫痫诊断及治疗的临床依据。