水环境下氢氧根水分子团簇催化赖氨酸旋光异构及羟自由基致损伤的机理*

赵晓波，佟华，杨晓翠，王佐成

(1. 白城师范学院化学学院，吉林 白城 137000；2. 白城师范学院物理学院，吉林 白城 137000)

赖氨酸(lysine，Lys)是生命体必须氨基酸，根据旋光性的不同，可分为左旋赖氨酸(S-Lys)和右旋赖氨酸(R-Lys)。S-Lys在生命体内是优构体，具有改善免疫系统、促进吸收钙和降低甘油三酯的作用。R-Lys是劣构体，无活性，主要用于生物化学研究。

由于Lys有重要作用，人们对它进行了广泛的研究。文献[1]研究了水液相环境下的S-Lys分子构象。文献[2]研究了S-Lys分子与糖美拉德反应产物的理化特性及抗氧化活性。文献[3-6]研究了Lys分子在裸环境、水汽相和液相环境下的旋光异构及羟自由基致其损伤。研究发现，裸反应优势通道决速步能垒为250.00 kJ·mol-1左右；水分子簇的催化决速步能垒降为150.00 kJ·mol-1左右，水溶剂效应使该能垒降至115.00 kJ·mol-1，羟自由基致赖氨酸损伤发生在旋光异构的主反应通道，损伤能垒是134.12 kJ·mol-1，水液相环境下变为无势垒反应。说明了生命体内Lys可以缓慢地旋光异构，羟自由基可致其快速地损伤。

富水的生命体有影响健康的氢氧根和羟基自由基存在[7]，氢氧根是否会对赖氨酸旋光异构产生影响，羟自由基致赖氨酸损伤在其他反应通道是否会发生，这些问题的讨论目前鲜见报道。有研究[8]表明，具有羧基与氨基间分子内单氢键和双氢键的氨基酸分子构象最稳定。基于此，对水环境下(水汽相和水液相)具有氨基与羧基间为单氢键和双氢键的2种Lys分子的标题反应进行了研究。

1 研究与计算方法

采用自洽反应场(SCRF)理论的smd模型方法[9]，在B3LYP[10]/6-31+G(d, p)水平，优化标题反应的驻点结构。通过对过渡态[11]进行IRC[12]计算，确认其可靠性。为计算出高水平的反应过程势能面，在MP2[13]/6-311++G(2df, pd)水平计算体系的单点能。利用Gtotal=ESP+Gtc(ESP和Gtc分别为高水平的单点能和吉布斯自由能热校正)计算总自由能，绘制反应过程的势能面。水液相环境下，S型Lys_1与2个水分子簇通过氢键作用形成的氢键络合物，记作S-Lys_1·2H2O(m)@water[m和n分别表示水分子簇在Lys分子的前面和后面与其络合)，其它体系表示法相似。计算均由Gaussian09[14]程序完成。

2 结果与讨论

具有氨基与羧基间单氢键及双氢键的Lys分子手性对映体的几何构象，见图1。从图1可以看出，S-Lys旋光异构，就是α-氢从纸面外迁移到纸面里。研究表明，水环境下S-Lys旋光异构有两个通道a和b实现，a是氢氧根水分子簇与α-氢和氨基通过氢键作用形成底物，氢氧根拔α-氢；b是氢氧根水分子簇与α-氢和羰基氧通过氢键作用形成底物，氢氧根拔α-氢；羟自由基致S-Val损伤，除去以往研究[5-7]的在a通道实现，还可发生在b通道。水溶剂效应对这些反应有重要的影响，下面分别进行讨论。

2.1 氢氧根水分子簇催化Lys_1旋光异构

2.1.1 氢氧根水分子簇催化Lys_1在a通道旋光异构 氢氧根水分子簇催化Lys_1在a通道的旋光异构，反应历程见图2，反应势能面，见图3。对于非氢迁移过程第1、2、5和第6基元反应，水溶剂的存在对驻点构象影响不大，只给出气相的构象。

首先，第1基元反应羧基异构，S-Lys_1经过渡态a_S-TS1_1，异构成中间体a_S-INT1_1。从S-Lys_1到a_S-TS1_1过程，二面角11C-9O-8C-10O和6H-5N-1C-12H分别从179.58°和-22.59°变为-90.45°和-49.07°，键长8C-9O从0.134 0 nm拉伸到0.138 8 nm。二面角异构和一个化学键较小的拉伸需要的能量不高也不会很低，a_S-TS1_1产生了49.12 kJ·mol-1的能垒。水溶剂环境下该能垒微降到48.76 kJ·mol-1，水溶剂效应不明显。从S-Lys_1到a_S-INT1_1，羧基从反式平面结构变成顺式平面结构，此时a_S-INT1_1与正面的氢氧根水分子簇形成氢键无空间位阻。接着，a_S-INT1_1经a_S-TS2_1，异构成略稳定的中间体a_S-INT2_1。此基元反应只是氨基的6H和7H左右翻转，所需能垒较低，只有12.34 kJ·mol-1。水溶剂环境下该能垒升高到21.34 kJ·mol-1，升高了72.9%，水溶剂效应对此基元反应起了明显的阻碍作用。原因是a_S-INT1_1的偶极矩3.746 7大于a_S-TS2_1的偶极矩1.919 5许多，导致水溶剂环境下a_S-INT1_1能量的降低大于a_S-TS2_1能量的降低许多。

图 1 水液相环境下S型与R型赖氨酸分子的几何结构Fig.1 The geometries of S-type and R-type of lysine molecule in water liquid environment

然后是第3基元反应，氢氧根水分子簇在α-氢25H与氨基氮5N的前面与S-INT2_1通过氢键作用形成的络合物a_S-INT2_1·[(OH-)·H2O(m)]，经过渡态络合物a_TS3_1·[(OH-)·H2O(m)]，实现了25H从α-碳向氢氧根29O-27H的迁移，形成了产物络合物a_INT3_1·2H2O(m)。此基元反应氢氧根抽取了α-H形成水分子，水分子28O-12H-26H未参与反应，但起了稳定氢氧根空间位置的作用。

a_TS3_1·[(OH-)·H2O(m)]七圆环结构的氢键键角1C-25H-29O、29O-26H-28O和28O-12H-5N分别是172.07°、161.03°和145.74°，前两个接近平角，氢键很强；二面角1C-25H-29O-26H、29O-26H-28O-12H和26H-28O-12H-5N分别为11.45°、0.72°和-21.92°，七圆环结构基本共面，因此a_TS3_1·[(OH-)·H2O(m)]较稳定。又从a_S-INT2_1·[(OH-)·H2O(m)]到a_TS3_1·[(OH-)·H2O(m)]过程，28O-26H从0.108 4 nm缩小到0.098 7 nm，释放能量；反应活性中心骨架二面角5N-1C-3C-8C从124.16°变为133.47°，1C-5N从0.147 8 nm拉伸到0.148 0 nm，骨架微小形变需要能量较小。1C-25H从0.111 3 nm拉伸到0.138 7 nm断裂，所需能量不会太高。因此，a_TS3_1·[(OH-)·H2O(m)]产生的能垒较低，只有20.59 kJ·mol-1。结构分析表明，a_INT3_1·2H2O(m)的水分子之间以及水分子和氨基之间存在较强的氢键，水分子和α-碳形成了弱氢键，a_INT3_1的5N-1C-8C-9O-10O形成了离域的大π键，因此a_INT3_1·2H2O(m)较稳定。但由于α-碳是sp2杂化，非满配，导致在势能面上a_INT3_1·2H2O(m)是处于比a_S-INT2_1·[(OH-)·H2O(m)]高的位置。

水溶剂效应使该基元反应能垒升高到78.13 kJ·mol-1。能垒大幅提升的原因，一是1C-5N从0.147 1 nm拉伸到0.148 3 nm，二是1C-25H从0.109 2 nm拉伸到0.143 4 nm，拉伸幅度相对于水汽环境的情况大幅增加；三是a_S-INT2_1·[(OH-)·H2O(m)]@water的偶极矩21.374 8大于a_TS3_1·[(OH-)·H2O(m)]@water的偶极矩6.857 6许多，在极性溶剂水中，a_S-INT2_1·[(OH-)·H2O(m)]体系能量的降低会显著大于a_TS3_1·[(OH-)·H2O(m)]体系能量的降低。

接着的第4基元反应近似第3基元的逆反应，2个水分子簇在a_INT3_1的后面与5N和1C通过氢键作用形成的络合物a_INT3_1·2H2O(n)，经过渡态络合物a_TS4_1·[(OH-)·H2O(n)]，形成了产物络合物a_R-INT4_1·[(OH-)·H2O(n)]，实现了α-碳从水分子28O-26H-29H抽取26H的过程。在此基元反应，水分子25O-24H-27H没参与反应，只是起了稳定水分子28O-26H-29H空间位置的作用，为α-碳1C抽取质子26H创造了条件。从a_INT3_1·2H2O(n)到a_TS4_1·[(OH-)·H2O(n)]过程，28O-26H从0.100 3 nm增加到0.135 8 nm，拉伸幅度0.035 5 nm比第3基元的反应物到过渡态1C-25H的拉伸幅度0.027 4 nm略有增加，所需能量会有所升高。但从a_INT3_1·2H2O(n)到a_TS4_1·[(OH-)·H2O(n)]过程，二面角5N-1C-3C-7C从-161.87°变为-137.88°，α-碳从sp2杂化向sp3杂化过渡，体系又会释放能量，因此，a_TS4_1·[(OH-)·H2O(n)]产生的能垒是23.64 kJ·mol-1，与a_TS3_1·[(OH-)·H2O(n)]产生的能垒相差不是多。结构分析表明，a_R-INT4_1·[(OH-)·H2O(n)]具有2个分子间强氢键，α-碳是sp3杂化，处于满配状态，构象稳定。水溶剂化效应使该基元反应的能垒升高到29.77 kJ·mol-1，a_R-INT4_1·[(OH-)·H2O(n)]@water相对于a_INT3_1·2H2O(n)@water的能量大幅降低，原因相似于第3基元反应，不再赘述。

图2 水环境下氢氧根离子水分子簇催化Lys_1在a通道旋光异构Fig.2 Optical isomerism of hydroxide ions-water clusters catalyzed Lys_1 in channel a in water liquid environment

经过第3和4基元反应，完成了α-氢从纸面外向纸面里的净迁移，S-INT2_1实现了旋光异构，亦即，S-Lys_1完成了旋光异构。

最后，a_R-INT4_1经5、6基元反应，实现了氨基翻转和羟基旋转异构两个过程，异构成产物a_R-Lys_1。结构分析表明，a_R-Lys_1具有氨基和羧基间较强的分子内单键键，构象更稳定[8-9]。

2.1.2 氢氧根的水分子簇催化Lys_1在b通道旋光异构 为节省篇幅，仅对水液相环境下的反应机理进行讨论。水溶剂环境下氢氧根水分子簇催化Lys_1在b通道旋光异构反应历程，见图4; 反应过程势能面，见图3。

图3 氢氧根离子水分子簇催化Lys_1旋光异构反应过程的吉布斯自由能势能面Fig.3 Gibbs free energy surface of the process of optical isomerism reaction of Lys_1 catalyzed by hydroxide ions-water clusters

首先，氢氧根的水分子簇在S-Lys_1的前面与α-氢25H和羰基氧10O通过氢键作用形成的前驱络合物b_S-Lys_1·[(OH-)·H2O(m)]@water，经过渡态络合物b_TS1_1·[(OH-)·H2O(m)]@water，形成中间体产物络合物b_INT1_1·2H2O(m)@water，氢氧根从α-碳上抽取了25H形成水分子。此基元反应相似于a通道的第3基元反应，水分子28O-24H-27H并没参与反应，只是起到了稳定氢氧根空间位置的作用。结构分析表明，过渡态b_TS1_1·[(OH-)·H2O(m)]@water的八元环结构基本共面，3条氢键较强，很稳定；从b_S-Lys_1·[(OH-)·H2O(m)]@water到b_TS1_1·[(OH-)·H2O(m)]@water过程，活性中心的骨架二面角5N-1C-3C-8C从122.11°变为132.52°，1C-5N键长从0.147 8 nm微缩到0.147 7 nm，骨架形变较小，b_TS1_1·[(OH-)·H2O(m)]@water不会产生较高的能垒。但1C-25H从0.109 7 nm拉伸到了0.143 2 nm，需要一定的能量，因此，b_TS1_1·[(OH-)·H2O(m)]@water产生了49.94 kJ·mol-1的能垒。结构分析表明，b_INT1_1·2H2O(m)@water具有水分子间、水分子与b_INT1_1间的强氢键，还具有水分子与b_INT1_1间的弱氢键，因此，b_INT1_1·2H2O(m)@water是较稳定的中间体络合物。

图4 水液相环境下氢氧根离子水分子簇催化Lys_1在b通道的旋光异构反应过程Fig.4 The process of optical isomerism of hydroxide ions-water clusters catalyzed Lys_1 in channel b in water liquid environment

然后，2个水分子簇在b_INT1_1的后面与α-碳和羰基氧通过氢键作用，形成中间体反应物络合物b_INT1_1·2H2O(n)@water，经过渡态b_TS2_1·[(OH-)·H2O(n)]@water，b_INT1_1·2H2O(n)@water抽取了水分子29O-25H-26H上的25H，形成产物b_R-Lys_1·[(OH-)·H2O(n)]@water。从b_INT1_1·2H2O(n)@water到b_TS2_1·[(OH-)·H2O(m)]@water过程，1C-5N键长从0.145 9 nm拉伸到0.147 4 nm，24O-20H键长从0.098 9 nm拉伸到0.122 4 nm，拉伸幅度较小。又反应活性中心骨架二面角5N-1C-3C-8C从-169.65°变为-139.24°，α-碳从sp2杂化向sp3杂化(从空配状态向满配状态)过渡，是放热过程。因此，b_TS2_1·[(OH-)·H2O(n)]@water产生了低于b_TS1_1·[(OH-)·H2O(m)]@water的能垒，只有19.88 kJ·mol-1。

经过1、2两个基元反应，相当于α-氢在氢氧根水分子簇和2个水分子簇的连续作用下，实现了从纸面外向纸面内的净迁移，S-Lys_1在b通道完成了旋光异构。

从图3可以看出：水液相环境下，氢氧根水分子簇催化Lys_1的旋光异构反应在b通道具有绝对优势，决速步能垒是49.94 kJ·mol-1，在另一通道a的决速步能垒是78.13 kJ·mol-1。49.94 kJ·mol-1已低于质子迁移温和反应的能垒84.00 kJ·mol-1[15]许多，在b通道的异构反应会较快的进行。78.13 kJ·mol-1已略低于质子迁移温和反应的能垒84.00 kJ·mol-1[15]，在a通道的异构反应也会温和进行，但速率会明显降低。这说明，生命体内有大量的氢氧根存在时，Lys_1会较快的旋光异构，严重影响健康。

2.2 氢氧根水分子簇催化Lys_2旋光异构

氢氧根水分子簇催化Lys_2在a通道的旋光异构反应历程，见图5(A)，反应势能面见图6。机理相似于Lys_1在a通道旋光异构过程的第3和4基元反应，这里只做一般讨论。

首先是第一基元反应。在水分子的协助下羟自由基抽取了a_S-Lys_2的α-氢，得到中间体络合物a_INT1_2·2H2O(m)。然后是第2基元反应，2个水分子簇在a_INT1_的另一侧与a_INT1_2通过氢键作用形成络合物a_INT1_2·2H2O(n)，经过渡态a_TS2_2·[(OH-)·H2O(n)]，a_INT1_2的α-碳抽取了1个水分子上的氢，形成了产物络合物a_R-Lys_2·[(OH-)·H2O(n)]。实现了α-氢从纸面外向纸面内的净迁移，S-Lys_2完成了旋光异构。

从图6可以看出，决速步骤是第1基元反应，水汽相环境的决速步能垒是32.98 kJ·mol-1，水溶剂效应使此能垒升高到68.76 kJ·mol-1，说明水溶剂对此反应起了较大的阻碍作用。

水汽相环境的决速步能垒32.94 kJ·mol-1已远低于质子迁移温和反应的能垒84.00 kJ·mol-1[16]，说明水汽环境下，Lys_2会极其迅速地损伤与消旋。水液相环境下的决速步能垒68.76 kJ·mol-1低于质子迁移温和反应的能垒84.00 kJ·mol-1[15]许多，说明在生命体内水液相下Lys_2会在b通道消旋。

水液相环境下，氢氧根水分子簇催化Lys_2在b通道旋光异构，首先是第1基元反应，水分子簇作氢迁移媒介，11H从10O迁移到9O，形成中间体b_S-INT1_2，反应能垒是45.6 kJ·mol-1[4]。然后是第2基元反应(相似于构象1在b通道旋光异构的第1基元反应)，氢氧根水分子簇与b_S-INT1_2的α-氢和新羰基氧10O通过氢键作用形成的络合物b_S-INT1_2·[(OH-)·H2O(m)]@water，经过渡态络合物b_TS2_2·[(OH-)·H2O(m)]@water，氢氧根拔取了α-氢，形成b_INT2_2·2H2O(m)@water，计算表明，此基元反应是决速步骤，能垒是60.41 kJ·mol-1。接下来的第3基元反应是α-碳在另一侧抽取水分子的质子，Lys_2在b通道完成旋光异构，此基元反应相似于构象1在b通道旋光异构的第2基元反应，从略。这里只给出了决速步骤的反应过程见图5(B)，势能面见图6。

2.3 羟自由基致Lys在b通道的损伤

水分子辅助羟自由基致Lys_1在b通道损伤的反应历程，见图7(A)，反应势能面见图8。

首先，羟自由基水分子簇在S-Lys_1的前面，通过与α-氢25H和羰基氧10O的氢键作用形成前驱络合物b_S-Lys_1·[(HO·)·H2O(m)]。然后，经过渡态络合物b_TS1_1·[(HO·)·H2O(m)]，羟自由基抽取了α-碳上的氢原子形成水分子，形成产物络合物b_P*_1·2H2O(m)。b_P*_1的α-碳已经失去了手性，也就是说，P*_1是Lys_1损伤的产物(这里星号表示产物非手性，是损伤的氨基酸)。此基元反应相似于a通道的第3基元，水分子28O-24H-27H没参与反应，只是起到了稳定羟自由基空间位置的作用。结构分析表明，过渡态b_TS1_1·[(HO·)·H2O(m)]的八元环结构基本共面，3条氢键较强，很稳定；从b_S-Lys_1·[(HO·)·H2O(m)]到b_TS1_1·[(HO·)·H2O(m)]过程，反应活性中心骨架二面角5N-1C-3C-8C从118.58°变为123.22°，骨架只是微小形变，并且1C-5N键长从0.147 7 nm缩小到0.145 1 nm要释放能量；1C-25H键长从0.109 7 nm到0.117 0 nm小幅拉伸需要的能量较小。因此，b_TS1_1·[(HO·)·H2O(m)]产生的能垒很低，只有13.78 kJ·mol-1。结构分析表明，b_P*_1·2H2O(m)具有5条较强的分子间氢键和一条分子内单氢键，5N、1C、8C、9O、10O形成了5中心离域大π键，因此，b_P*_1·2H2O(m)极稳定。

水溶剂化计算表明，水溶剂效应使损伤能垒升高，能垒是27.57 kJ·mol-1，损伤产物络合物也很稳定。说明水溶剂效应对羟自由基致Lys_1在b通道的损伤反应起了负催化作用。

Lys_2在b通道的损伤发生在第2基元反应，反应历程见图7(B)，反应势能面见图8。羟自由基水分子簇与b_S-INT1_2的α-氢25H和新羰基氧10O通过氢键作用形成的络合物b_S-INT1_2·[(HO·)·H2O(m)]，经过渡态b_TS2_2·[(HO·)·H2O(m)]，羟自由基拔取了α-氢25H，形成b_P*_2·2H2O(m)。机理相似于Lys_1在b通道的损伤，不再赘述。势能面计算表明，水汽环境下的损伤能垒是-1.16 kJ·mol-1，水溶剂效应使该能垒微微升到0.68 kJ·mol-1，水溶剂效应不显著。

图5 水环境下氢氧根离子水分子簇催化Lys_2旋光异构过程Fig.5 Optical isomerism of hydroxide ions-water clusters catalyzed Lys_2 in water liquid environment

图6 氢氧根离子水分子簇催化Lys_2旋光异构反应过程的吉布斯自由能势能面Fig.6 Gibbs free energy surface of optical isomerism reaction of Lys_2 catalyzed by hydroxide ions-water clusters

图7 羟自由基水分子簇催化Lys在b通道的损伤反应过程Fig.7 Process of Lys_1 damaged by hydroxy radicals-water clusters in channel b

图8 羟自由基水分子簇致Lys在b通道损伤反应过程的吉布斯自由能势能面Fig.8 Gibbs free energy surface of Lys damaged by hydroxy radicals-water clusters in channel b

3 结 论

综上得到如下结论：

1) 赖氨酸旋光异构有2个通道a和b实现，a是氢氧根水分子团簇与α-氢和氨基氮通过氢键作用形成底物，氢氧根拔α-氢，然后α-碳再在另一侧拔水分子的氢；b是氢氧根水分子团簇与α-氢和羰基氧通过氢键作用形成底物，氢氧根拔α-氢，然后α-碳再在另一侧拔取水分子的氢。

2) 水液相环境下，构象1和2在a通道旋光异构的决速步能垒分别是78.13和68.76 kJ·mol-1，在b通道旋光异构的决速步能垒分别是49.94 和60.41 kJ·mol-1，说明生命体内氢氧根的存在会导致赖氨酸较快地旋光异构。

3) 水液相环境下，羟自由基水分子簇致赖氨酸在b通道的损伤是低势垒放热反应，生命体内羟自由基的存在会导致赖氨酸较快地损伤。