异甘草素对人肝癌HepG2细胞的增殖及超微结构的影响❋

马 朋 曹 璋 张瑾锦 曹同涛△

(滨州医学院, 1 药学院, 2 基础学院, 3 医药研究中心, 烟台 264003)

异甘草素(isoliquiritigenin, ISL)(2′,4,4′-三羟基查尔酮)是一种具有查尔酮结构的黄酮类化合物,是甘草及多种植物中的活性成分之一。异甘草素目前已经被证明具有广泛的生物学活性,尤其在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗自由基、松弛血管等方面都具有较好的效果[1-3],但有关异甘草素抗肝癌作用的报道较少。本研究以异甘草素为实验药物,初步探讨异甘草素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

异甘草素购于大连美仑生物技术公司;DMEM培养基和胎牛血清为HyClone公司产品;细胞培养板为Corning公司产品;Cell Counting Kit (CCK8)试剂盒和Annexin-FITC/PI细胞凋亡测试试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 人肝癌HepG2细胞的培养及处理

人肝癌HepG2细胞由本实验室保存,以含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,常规消化传代。取处于对数生长期的HepG2细胞,胰酶消化后加入培养液制成细胞悬液,调整细胞浓度按1×103个/孔的密度接种于96孔板。培养24h待细胞贴壁后,分成空白对照组、溶剂对照组和6个不同浓度的药物实验组。空白对照组只加入DMEM培养液;溶剂对照组加入含0.1% DMSO的DMEM培养液;6个实验组分别加入先用二甲基亚砜(DMSO)溶解、再经DMEM培养液稀释至终浓度为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00mg/L的异甘草素(含DMSO≤0.1%[4])。每组设6个平行孔。

1.3 CCK8法检测细胞增殖情况

异甘草素作用HepG2细胞24h和48h后,各孔中加入10μl的CCK8溶液,培养箱中孵育2h,用TECAN M200酶标仪测定450nm处的光密度OD值[5]。空白孔调零,实验重复3次,取平均值,根据下列公式计算细胞的增殖抑制率。

细胞增殖抑制率=(1-OD实验组/OD对照组)×100%

1.4 透射电镜观察细胞超微结构

40mg/L异甘草素处理人肝癌HepG2细胞24h后,收集所有细胞,加入2.5%的戊二醛固定液4℃ 1500r/min 离心5min,弃去上清液。PBS洗1次,1500r/min 离心5min。取一洁净的EP管,用微量移液器注入10～20μl血清,取离心后的细胞团块放入EP管中,注入2.5%的戊二醛固定液,2000r/min离心5min,弃上清,把细胞团块小心挑起,移入已加固定液的青霉素小瓶中,送专业实验室制备透射电镜样品,JEM1400透射电子显微镜观察并照像。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率

以5、10、20、40mg/L的异甘草素作用HepG2细胞24h和48h后,用不含EDTA的胰酶消化细胞并制成单细胞悬液,将细胞移至离心管中,2000r/min离心5min后收集细胞。用PBS缓冲液洗涤2次,调整细胞浓度至1×106/ml,采用南京凯基生物科技公司的Annexin-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,按试剂盒提供的方法进行AnnexinⅤ-PI染色,经FACscan流式细胞仪上机检测。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 异甘草素对HepG2细胞增殖的抑制作用

不同浓度的异甘草素(1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00mg/L)作用HepG2细胞24h和48h后,对细胞的生长有明显的抑制作用,细胞的增殖抑制率呈现出浓度和时间依赖性(表1)。与相应空白对照组比较,不同浓度异甘草素的增殖抑制率均有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同浓度异甘草素对肝癌HepG2细胞增殖的抑制率±s, %)

*P<0.05vs0mg/L

2.2 电镜观察HepG2细胞超微结构的变化

正常培养的对照组肝癌HepG2细胞透射电镜下可见细胞边缘界限清晰,细胞核为正常形态(图1A)。40mg/L异甘草素作用HepG2细胞24h后,观察到细胞核染色质高度凝集,断裂分解为大小不等的球形结构,出现凋亡小体(图1B),呈明显的细胞形态改变。

图1 异甘草素作用HepG2细胞的超微结构,标尺=2μm

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率

采用AnnexinⅤ和PI双染分析细胞凋亡率,可以将正常细胞、凋亡早期细胞、凋亡中晚期细胞和坏死细胞区分开[6-7]。空白对照组细胞中凋亡细胞含量较低,而不同浓度异甘草素作用24、48h后,凋亡细胞百分率逐渐增高,与相应时间的空白对照组相比差异均有统计学意义,存在明显的时间依赖性和浓度依赖性(表2)。

表2 异甘草素作用后HepG2细胞的凋亡率±s, %)

*P<0.05vs0mg/L

3 讨论

肝癌是威胁人类生命健康的严重疾病之一,也是众多发展中国家的常见疾病,发病率高达80%[8-9]。肝癌具有发病隐藏,初期症状不典型,恶性程度高,死亡率和发病率都极高的特点。因此,寻找高效的抗肝癌药物一直是抗肿瘤药物研究领域关注的热点。

异甘草素是一种异黄酮类化合物,主要存在于甘草及其他多种植物的根部。异甘草素具有广泛的药理活性,在抗肿瘤、抗氧化、抗炎、扩张动脉、保护心和脑等方面具有较好的生物学活性。近年来研究表明,异甘草素对多种肿瘤具有明显的抑制作用[10-11],但有关异甘草素抗肝癌作用的报道较少。本实验研究异甘草素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。

本实验CCK8法检测结果显示异甘草素对人肝癌HepG2细胞有明显的增殖抑制作用,并呈良好的浓度和时间依赖性。通过透射电镜观察到,异甘草素作用后人肝癌HepG2细胞结构出现明显的形态改变,具有细胞核染色质高度凝集,断裂分解为大小不等的球形结构,出现凋亡小体等现象。用AnnexinⅤ和PI双染流式细胞仪分析细胞凋亡率,结果显示异甘草素可诱导肝癌HepG2细胞凋亡,不同浓度异甘草素作用24h和48h后,细胞凋亡率显著增加。

以上研究结果表明,异甘草素可引起人肝癌HepG2细胞超微结构明显改变,并能引起HepG2细胞凋亡,进而发挥其对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。但其具体的分子作用机制还不清楚,有待进一步深入研究。