5 L发酵罐中棘白菌素B发酵工艺参数优化

胡晓龙，秦海彬，吴旭萍，毛健，邹树平，牛坤

(浙江工业大学 浙江省生物有机合成研究重点实验室，浙江 杭州，310014)

阿尼芬净是棘白菌素类“王牌抗生素”，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1, 3-葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的目的[1]。目前该药物已在美国和欧洲批准上市，而国内尚在临床阶段，无企业生产此类药物，导致其市场垄断、价格高，因此对该药物的高效生产技术进行研发，实现其国产化，将有助于打破国际制药企业的垄断，为患者提供价廉质优的抗真菌药物，具有重要的经济和社会效益[2]。

该药物主要通过对棘白菌素B(Echinocandin B, ECB)的脂肪酸侧链进行修饰替换而得到，因此，ECB是阿尼芬净的重要前体物质，其发酵产量的高低显著影响阿尼芬净的生产成本[3-5]。目前，国内外棘白菌素B均采用微生物发酵法进行制备，其中主要是以工业化的Aspergillusrugulosus菌株和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)进行发酵，而目前其发酵产量过低仍是限制阿尼芬净产业化的关键问题。前人对棘白菌素类抗生素的发酵过程已经开展了大量研究，包括温度、pH值以及培养基组成等。与生产纽莫康定B0和FR901379的发酵过程相似，合成ECB的最适温度一般为24～28 ℃，而A.rugulosus的最适生长温度则在37 ℃左右，在ECB最适生产温度24～28 ℃则生长缓慢，且该菌发酵生产ECB对温度表现出极高的敏感度，在37 ℃发酵液中几乎没有ECB的生成[6-7]。除此之外，ECB的六肽支架结构主要由6个氨基酸组成：4R, 5R-二羟基-L-鸟氨酸、L-苏氨酸、4R-羟基-L-脯氨酸、3S, 4S-二羟基-L-高酪氨酸、L-苏氨酸和3S-羟基-4S-甲基-L-脯氨酸[1]。因此，在许多文献中考察了不同氨基酸前体的添加对ECB发酵产量的影响，例如添加15 g/L的L-酪氨酸和L-苯丙氨酸能达到比较好的结果，因为它们可以合成4-羟基-苯基-丙酮酸，是高酪氨酸合成的前体[8]。国内有关发酵制备ECB的文献较少，上海医药工业研究院报道了关于制备ECB的方法，其产量为712 mg/L[9]；华北制药集团在高纯度制备ECB方法的专利中报道ECB产量为750～850 mg/L[10]；2013年上海医药工业研究院对ECB的生产方法进行了报道，产量为750～900 mg/L[11]，相对较低的产量也反映出该丝状真菌在发酵过程中碰到的一些难以克服的技术问题，如发酵液粘度过高，供氧不足以及传质受阻等，本实验室也开展了大量工作，通过菌种改造、发酵培养基优化等方法可以使摇瓶发酵过程中ECB产量稳定在2 000 mg/L以上[12-14]。

本文在上述摇瓶发酵的基础上考察了5 L机械搅拌罐中的发酵情况，对其中影响曲霉生长的主要因素，如搅拌桨类型、搅拌转速以及通气量等进行了考察，从而优化ECB在发酵罐中的发酵条件，为后续中试及生产放大提供一定的数据基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

菌株AspergillusnidulansZJB09223，为本实验室保藏菌株。该菌株在摇瓶中的发酵产量维持在2 000 mg/L左右。

1.2 培养基

斜面培养基：PDA培养基。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，甘油10，棉籽粉25，pH 6.8～7.0。

发酵培养基(g/L)：花生油20，甘油10，蛋白胨10，L-脯氨酸5，甘露醇100，康明威豆粕40，K2HPO4·3H2O 10，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl20.5，CuSO40.6，鸟氨酸6，番茄粉15，pH 7.0。

1.3 培养方法及培养条件

斜面培养：用无菌环从甘油管中挑取少量的孢子接种到新鲜PDA斜面培养基中，25 ℃避光倒置培养12～14 d，菌体颜色由白色变为墨绿色。

种子液培养：从斜面培养基上用无菌接种铲挑取0.5 cm×1.0 cm左右的菌落接种于装有种子培养基的三角瓶中(100 mL/500 mL)，置于调速摇床上培养2 d(25 ℃，220 r/min)。

摇瓶发酵培养：将上述种子液按照10%接种量(v/v)接入液体发酵培养基中，220 r/min，25 ℃培养12 d。发酵过程中，发酵液由白色渐渐变成红色，最后加深变为深褐色。

发酵罐初始培养条件：将培养48 h的种子液按10%接种量(v/v)接种于5 L发酵罐中，于25 ℃，400 r/min，通气量1.0 VVM，初始pH 6.5的条件下，培养15 d。

1.4 分析方法

生物量(g/L)：取20 mL菌液离心去上清液，菌体放入烘箱90 ℃烘干至衡重，计算得到生物量。

ECB的检测：ECB采用高效液相色谱仪(LC-2010A，岛津)分析检测，色谱柱为C18柱(大连依利特4.6 mm×250 mm×5 μm)；流动相为V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=7∶1∶2；流速1 mL/min；紫外检测波长222 nm；进样量20 μL; 柱温40 ℃。取ECB标品(GC>99 %)，溶于甲醇中，配制成不同浓度的标品溶液，取1mL于液相瓶中进行液相检测。

发酵液预处理：取1 mL发酵液于2 mL EP管中，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清液；剩余菌体加入5 mL甲醇萃取静置30 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min；取上清用0.22 μm有机膜过滤后，进行液相检测。

2 结果与分析

2.1 Aspergillus nidulans ZJB09223在5 L机械搅拌罐中的发酵特性

本实验的发酵液黏度较高，而机械搅拌式生物反应器具有较强的剪切力和传质速率，因此本研究选用5 L 机械搅拌罐，考察该发酵过程的基本特性。选择种龄为48 h的种子液、培养温度25 ℃，pH 6.5的条件下进行培养。在通气量为1.0 VVM、搅拌转速400 r/min条件下发酵进程如图1所示。

图1 Aspergillus nidulans ZJB09223在5 L机械搅拌发酵罐中的发酵特性Fig.1 Profile of Aspergillus nidulans ZJB09223 fermentation in 5 L mechanical agitating fermentor

从图1可知，在发酵初期菌丝体即开始大量生长，发酵液中部分菌体附着在固形碳氮源上，形成大小不一的菌丝球，部分菌丝呈絮状生长，在发酵第4天即达到细胞干重的最大值，89.5 g/L。同时，发酵液黏度不断增加，溶氧显著下降到13%左右，发酵液出现白色絮状菌丝；第4～8天，发酵液中的固形碳氮源被大量消耗，菌丝球减少，大量菌丝体呈絮状生长，并附着在搅拌桨、发酵罐内壁以及挡板上结块生长，直到发酵结束菌体量下降至52 g/L左右。在菌体下降的过程中，发酵液颜色由白色变为橘红和红棕色，ECB作为次级代谢产物产量逐渐增加，在发酵第14天达到峰值207 mg/L。菌丝破裂释放胞内酸性物质使pH值缓慢降低，发酵液颜色进一步加深，变为深褐色。与此同时，发酵液中溶氧开始回升至30%左右。

在发酵过程中未调控pH值的情况下，pH值基本维持在6.5左右，而当发酵进行至第11天后，pH值开始呈现缓慢降低，最终降到6.0，这主要是因为细胞破裂，胞内酸性物质的释放造成的。以上结果表明，生物反应器相比于摇瓶中生产ECB积累有所延迟，其原因可能是在菌体开始大量生长的阶段，发酵罐中的溶氧水平较低，菌丝体未达到最佳生长状态，前体物质合成量不足，而且相关酶进行羟基化效率不高，最终影响了次级代谢产物的生成。另外，在发酵罐中搅拌区域有限，菌丝体会附着在罐壁及发酵罐上部，达不到搅拌效果，无法摄取营养物质合成次级代谢产物，因此，对发酵罐搅拌桨进行改造是十分必要的。

2.2 搅拌桨类型对棘白菌素B合成的影响

目前大多数机械搅拌发酵罐采用径向流涡轮式搅拌器，但有研究表明，将轴向流的搅拌器应用于真菌发酵有很多优势，尤其是高密度、高黏度的微生物发酵。与径向流搅拌器相比，轴向流搅拌器在介质的功率消耗、混合性能或者传质效果等方面都更优越。本实验以发酵罐原装的六直叶圆盘涡轮搅拌器为对照，以初始条件考察了框式搅拌器和双折叶搅拌器对发酵生产ECB的影响，见图2。

a-框式搅拌器；b-双折叶搅拌器图2 框式搅拌器和双折叶搅拌器的规格参数Fig.2 Specification parameter of gate agitator and double folded blade agitator

实验结果如图3所示，在发酵0～6 d，3种搅拌器对应的反应器中菌丝浓度均快速增长，但是框式搅拌器的搅拌面积大，气液混合效果更好，第4天生物量可以达到最大值98.5 g/L。相比而言，双折叶搅拌器表面积较小，在菌体上升一定浓度后已经不太适应较黏稠的发酵液搅拌，生物量增长较慢，菌体最大值仅为86.5 g/L。六直叶圆盘涡轮搅拌器的混合效果介于两者之间，生物量为94 g/L。在发酵第6～15天，框式搅拌器形成的高剪切力损伤了菌丝体，菌丝浓度快速下降至46.5 g/L，导致产物ECB产量由99 mg/L下降为75 mg/L。而装有圆盘涡轮搅拌器的发酵罐中的菌丝体受剪切力影响较小，菌丝损伤小，开始大量生成产物，最终产物质量浓度为213 mg/L。双折叶搅拌器对应的发酵罐中菌丝体受剪切力影响最小，但由于生长前中期发酵液搅拌混合不佳，溶氧水平较低影响了前体物质的合成，导致后期ECB生成能力降低，最终产量仅为106 mg/L。综上所述，由于丝状真菌的本身特性使得搅拌桨类型对菌体生长及次级代谢产物的合成具有较大的影响，而本实验由于时间有限未能得到较优的搅拌桨类型，后续可进一步改善搅拌桨结构，例如，安装2根独立的搅拌器，靠近空气分布器的位置使用高速运转的六直叶圆盘涡轮搅拌器，有利于打碎气泡，提高氧传递速率。罐身中部使用慢速的轴向流搅拌器，有利于中高黏度液体的混和，强化传质效果，这样可能更有利于ECB的发酵生产。

a-棘白菌素B产量；b-菌体干重图3 搅拌桨类型对棘白菌素B发酵过程的影响Fig.3 Effect of different agitators on ECB fermentation process

2.3 搅拌转速的优化

对高黏度发酵过程而言，搅拌转速也是发酵过程的重要参数，本实验在原有发酵条件下，在300～600 r/min范围内初步设置4个梯度的恒定转速，进一步对搅拌转速控制工艺进行优化。图4-a显示搅拌转速对ECB的产量有较大的影响，从300 r/min开始，随着搅拌转速的提升ECB产量也随之提高，在500 r/min时，产量达到最大值317 mg/L，600 r/min条件下，ECB初期产量较大，第9天以后产量增速放缓，在第11天产物积累的量为193 mg/L，因此，最适恒定搅拌转速控制于500 r/min，此时ECB产量为317 mg/L，效价比选用六直叶圆盘涡轮搅拌器后提高了47 %。

图4-b表明在发酵0～6 d，搅拌转速300～600 r/min范围内，菌丝体浓度与搅拌转速成正比，而到发酵后期，除了300 r/min条件外，其他转速菌丝浓度与搅拌转速成反比。600 r/min条件下第0～6天菌丝体浓度较高，达到103 g/L，第7天后开始下降，这可能是由于在菌丝衰亡期，搅拌速度过快会造成剪切力较大，对菌丝形态造成损伤，致使产物代谢异常，产量降低。搅拌转速为400 r/min时，由于发酵第0～6天菌丝体生长没达到最佳状态，中间产物积累较少，即使后期菌丝浓度有所增加，产物产量仍然很低(215 mg/L)。搅拌转速为300 r/min时，发酵液混合不均匀，搅拌效果不佳，靠近发酵罐外壁的发酵液黏度高，导致ECB菌丝体浓度和产量均处于较低水平。

a-棘白菌素B产量；b-菌体干重图4 不同搅拌转速对棘白菌素B发酵过程的影响Fig.4 Effect of different stirring speed on ECB fermentation process

在研究恒定转速对ECB发酵过程的影响时发现，第0～8天，600 r/min的条件下菌丝体浓度最大，但是发酵结束时产物的产量较低，仅为175 mg/L，说明该条件是菌丝体生长的最适搅拌转速而不是产物合成时的最适搅拌转速。由于菌丝体在发酵后期第7～15天对剪切力较为敏感，如果在最适菌丝体浓度下，适当降低搅拌转速可能有利于ECB产量的提高。因此设计了如下几组实验进行比较：(1)搅拌转速由600 降至500 r/min；(2)搅拌转速由600降至400 r/min；(3)搅拌转速由600 r/min降至300 r/min；(4)搅拌转速恒定500 r/min。发酵第6天改变转速，其中最适的恒定搅拌转速500 r/min作为对照组。实验结果见图5。

a-棘白菌素B产量；b-菌体干重图5 分阶段控制搅拌转速对棘白菌素B合成的影响Fig.5 Effect of control agitator speed at different stages on ECB fermentation process

在第0～6天菌丝体生长和稳定阶段，提高搅拌转速菌丝体浓度有一定上升，搅拌混合效果较好，中间代谢产物大量积累，对最终产物的合成有积极的影响。在第6～15天产物大量合成阶段，将搅拌转速适当降低至500 r/min，有利于ECB产量的提高，如果转速降低至300 r/min，会导致发酵液中溶氧水平下降，ECB产量仅为288 mg/L。实验结果表明，在第0～6天搅拌转速控制600 r/min，第6～15天搅拌转速降至400 r/min，有利于产物生成，ECB产量可以达到462 mg/L，比对照组提高了44%。采用分阶段控制搅拌转速，一方面可以提高ECB的产量，另一方面也关系到工业化生产的能耗，因此后续可以进一步优化改变转速的时间点，以确定既能提高产物产量又能节省能耗的调控策略。

2.4 通气量的优化

影响产量的因素除了剪切力，溶氧也是重要因素。氧气是氧化磷酸化过程中最终的电子受体，发酵前期溶氧不足时，NADH氧化成NAD+的过程受阻，导致NADH的积累，减少了ATP的合成，而且包括菌体生长在内的生理生化反应都受到影响。到发酵中后期，由甘露醇提供的NADPH为加氧酶提供修饰六肽环的能量，次级代谢产物大量合成，此时溶氧不足会直接影响产物的产量[15]。因此，本实验在控制搅拌转速的前提下，进一步研究溶氧对ECB合成的影响。实验分别考察了1.0～2.0 VVM通气量对ECB合成的影响，结果如图6所示。

a-棘白菌素B产量；b-菌体干重图6 不同通气量对棘白菌素B合成的影响Fig.6 Effect of different ventilation on ECB fermentation process

实验结果表明，不同的通气量对菌体生长和ECB合成的影响趋势基本相同，通气量的增加可以明显提高菌体的生物量，在1.0～1.7 VVM范围内，随着通气量的增加菌丝体最高生物量由98.5 g/L上升到106.5 g/L，有较大提高，再进一步增加到2 VVM时，菌体量基本保持不变。就ECB发酵产量而言，随着通气量的提高，其产量也有所增加，在1.7 VVM时达到608 mg/L，比1.0 VVM条件下提高32%。而在通气量为2 VVM时，过大的通气量容易使发酵液喷射到发酵罐罐顶内壁上，菌体在上部大量生长容易堵住补水孔及出气孔，增加罐压及染菌风险，而且增加了能耗，因此，综合考虑以上情况，在5 L发酵罐中使用1.7 VVM恒定通气量。

综上所述，ECB在发酵罐中产量远低于摇瓶中产量(2 000 mg/L)，主要原因是两者发酵液传质方式和溶氧水平有差异。ECB在摇瓶中发酵时，发酵液振荡混合均匀、溶氧充分；而在发酵罐中由于生长对数期发酵液粘稠，虽然靠近搅拌桨处发酵液搅拌充分，而远离搅拌桨处发酵液流动缓慢传质效果不佳，发酵液混合不均匀导致氧气在发酵液中分布不均，不仅致使ECB产量减少而且延长了ECB发酵周期。另外，搅拌桨的高速运转在一定程度上损伤了菌丝体，使得细胞干重比摇瓶中要低，从而导致ECB产量的降低。

3 结论

实验对AspergillusnidulansZJB09223在5 L机械搅拌发酵罐中的培养条件进行了初步探索，为ECB发酵过程的放大探明基本条件及影响因素。通过搅拌桨类型的对比，发现在本实验条件下六直叶圆盘涡轮搅拌器更适合发酵生产ECB，而后续应该继续在搅拌桨类型方面进行研究，从而获得最优的搅拌条件。从ECB发酵产量和生产能耗角度以及菌体发酵过程中的代谢规律考虑，建立了两阶段搅拌转速控制方式，在1.7 VVM通气条件下，发酵第0～6天，搅拌转速控制600 r/min，发酵后期第6～15天，搅拌转速降为400 r/min，可使ECB发酵产量提高至608 mg/L。虽然该产量比未优化前提高了193 %，但相比摇瓶发酵水平仍有较大差距，因此，在后续ECB发酵放大过程中，需要综合考虑搅拌传质及溶氧对ECB发酵过程的影响，以进一步提高发酵罐中的发酵水平。