鳄鱼血干粉抑瘤及提高动物免疫功能作用研究

殷仁联

【摘要】目的：研究鳄鱼血干粉给药后，对荷瘤小鼠抑瘤作用以及对小鼠免疫功能的影响作用。方法：采用雌性小鼠，每组10只， 随机分为空白对照组、鳄鱼血干粉高剂量组（240mg/kg）、中剂量组（120mg/kg）和低剂量组（60mg/kg）。空白对照组给与双蒸水，各组均连续灌胃给药15d，每天1次，末次给药后，分别进行对小鼠Lewis肺癌、小鼠肉瘤S180、宫颈癌U14、ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化和小鼠NK 细胞活性实验。结果：鳄鱼血干粉对模型动物肿瘤生长具有明显的抑制作用，并可提高小鼠脾淋巴细胞转化能力和 NK 细胞活性。结论：鳄鱼血干粉可抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，并可增强小鼠的免疫功能。

【关键词】鳄鱼血干粉；肿瘤；免疫增强

【中图分类号】R455

【文献标志码】B

【文章编号】1005-0019（2018）09-038-01

鳄鱼肉、血和其他产品，已经被广泛消费，不仅因为它的营养成分，还在于它的药用价值。在很多亚洲文化传统中发现了食用鳄鱼血来改善人类健康的实践.最近鳄鱼血的抗菌活性得到了系统的研究，其中鳄鱼血抗肿瘤和提高免疫力效用受到更多的关注，有研究表明它对食管癌、结肠癌、乳腺癌等表现出良好的抗癌活性，这一作用有可能是通过提高机体免疫力而达到的。本研究围绕这一发现进行基础性研究，同时开展对动物免疫功能的探讨，寻找其可能的对机体修复和抑瘤的作用路径。

一、材料和方法

1样品和动物：鳄鱼血干粉购自三杰鳄鱼潭农业开发有限公司，取检验检疫合格的鳄鱼血，加热成血块，减压真空干燥后粉碎；选用上海西普尔-必凯实验动物有限公司繁殖的SPF级CI/F1代雌性小鼠，体重为18-22g，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2013-0016。

2剂量选择及分组：共小鼠Lewis肺癌、小鼠肉瘤S180、宫颈癌U14、小鼠免疫功能四批试验，每试验均分为四组，每组10只小鼠，分别为鳄鱼血干粉高、中、低剂量組以及空白组、阳性药组，其中试验药品组剂量设置为240、120、60mg/kg（分别相当于人体推荐用量的 20、10、5倍），上述剂量折合人用血粉为每日144、072、036g。分别给予相应剂量组动物灌胃，空白对照组予以等体积的蒸馏水，每天灌胃一次，连续灌胃 15天。

3主要仪器与试剂：T1000型电子天平、JA2003型电子天平、SG-603生物安全柜、二氧化碳培养箱、显微镜等。RPMI1640 培养液、小牛血清、SA 缓冲液、生理盐水等。

4试验方法：

41对小鼠Lewis肺癌的影响实验取小鼠右腋皮下接种Lewis肺癌瘤细胞悬液（瘤组织块：生理盐水为1：3）无菌匀浆02ml/只，接种后按体重随机分组，接种24小时后给药，除水对照组同体积的蒸馏水灌胃之外，其余各组灌胃04ml/只药液，每日一次，连续14天，于未次给药后次日，各组小鼠称重后处死，解剖并剥离瘤体，称重。

42对小鼠肉瘤S180的影响实验取小鼠右腋皮下接种肉瘤S180瘤细胞悬液（瘤组织块：生理盐水为1：3）无菌匀浆02ml/只，接种后按体重随机分组，接种24小时后给药，除水对照组同体积的蒸馏水灌胃之外，其余各组灌胃04ml/只药液，每日一次，连续14天，于未次给药后次日，各组小鼠称重后处死，解剖并剥离瘤体，称重。

43对小鼠宫颈癌U14的影响实验取小鼠右腋皮下接种宫颈癌U14瘤细胞悬液（瘤组织块：生理盐水为1：3）无菌匀浆02ml/只，接种后按体重随机分组，接种24小时后给药，除水对照组同体积的蒸馏水灌胃之外，其余各组灌胃04ml/只药液，每日一次，连续14天，于未次给药后次日，各组小鼠称重后处死，解剖并剥离瘤体，称重。

44ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验——MTT法各剂量组动物连续灌胃15天后，颈椎脱臼法处死动物，无菌取脾，放入1640培养液的平皿内剪碎过筛制成悬液，移入离心管放入1640培养液的平皿内剪碎过筛制成悬液，移入离心管用1640液洗并离心（1000rpm/分，10分，4℃）三次，弃上清加入2ml含10%小牛血清1640液，取悬液稀释计数，调成2×106/ml浓度，加入24孔培养板2ml/孔，平行分3孔，一孔为空白对照，一孔加con-A100μl/孔（终浓度5μg/ml），一孔加LPS100μl（终浓养72小时。在培养结束前4h，离心（2000rpm/分，10分，4℃），每孔弃去培养液16ml，加入16ml含10%小牛血清1640液，同时加入MTT（5μg/ml）100μl/孔，继续培养4小时。培养结束后，离心（2000rpm/分，10分，4℃），弃上清，每孔加入2ml二甲基亚砜，混匀，使紫色结晶完全溶解，721分光光度计（波长570nm）比色，记录结果。

淋巴细胞增殖能力=加ConA的光密度值-不加ConA的光密度值

45NK细胞活性测定——乳酸脱氢酶测定法各剂量组动物连续灌胃15天后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，研磨脾脏，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hanks液洗2次，每次离心10min（1000r/min），弃上清将细胞浆弹起，加入05mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入05mL 2倍Hanks液及8mL Hanks液，离心10min（1000r/min），用含10%小牛血清RPMI1640完全培养液重悬，1%冰乙酸稀释后计数，台酚兰染色计数活细胞数（均在95%以上），用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。

试验前24h将靶细胞（YAC-1细胞）传代培养，应用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。取YAC-1细胞和脾细胞各100μL（效靶比50：1）加入U型96孔培养板中，YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培养液各100μL，YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和25%Triton各100μL，上述各项均设三个平行孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应10min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值。

NK细胞活性（%）=反应孔OD值-自然释放孔OD值

最大释放孔OD值-自然释放孔OD值×100

5实验数据统计：应用 SPSS 统计软件进行方差分析统计处理。

二、结果

1鳄鱼血干粉对小鼠Lewis肺癌的影响

表1可见，鳄鱼血干粉在240-60mg/kg剂量下小鼠灌胃给药对小鼠Lewis肺癌生长具有明显的抑制作用。

2鳄鱼血干粉对小鼠肉瘤S180的影响

表2可见，鳄鱼血干粉在240-60mg/kg剂量下小鼠灌胃给药对小鼠肉瘤S180生长具有明显的抑制作用。

3鳄鱼血干粉对小鼠宫颈癌U14的影响

4鳄鱼血干粉对 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响

表4可见，鳄鱼血干粉在240-60mg/kg剂量下对小鼠脾淋巴细胞中加ConA孔与不加ConA孔吸光度高于对照组，差值有统计学意义。

5鳄鱼血干粉对小鼠的 NK 细胞活性的影响

表5可见，鳄鱼血干粉在240-60mg/kg剂量下对小鼠NK细胞活性高于对照组，差值有统计学意义。

三、讨论

目前，随着鳄鱼的人工养殖越来越广，鳄鱼除了食用等价值外，其保健、药用价值也正在被广泛利用。现代科学研究，鳄鱼肉、骨、血液及内脏富含蛋白质和人体所需的氨基酸、脂肪、碳水化合物、免疫球蛋白、维生素以及多种稀有生物元素，营养丰富，味道鲜美，能降低胆固醇，培补气血，强身健体，提高人体免疫力。鳄鱼血主要成分为蛋白质、脂肪酸、氨基酸、免疫球蛋白等成分，从目前的研究、食用情况看这几类成分都是人体所需的营养成分，没有任何毒性成分，可以看出鳄鱼血干粉是一种高蛋白、低脂肪的营养物质。英国和澳大利亚的科学家经研究均发现鳄鱼血中含有多种有效物质，其免疫系统能杀死爱滋病病毒，以及对青霉素具有抗体的病毒。近年来我国也有多个鳄鱼血提高免疫力的实验报道，如血液提取物测可在小鼠体内抗御海豚链球菌感染，体外对埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等10种细菌均有一定的抑菌效果。通过本实验，发现鳄鱼血粉对动物移植的瘤株有一定的抑制作用，并可增強小鼠的免疫功能，提高小鼠脾淋巴细胞转化能力和 NK细胞活性。以上的研究结果将有利于鳄鱼血产品的进一步开发和应用。

参考文献

[1]王春梅、庚迪、张敏，等，观察暹罗鳄鱼血干粉对小鼠免疫功能的影响，求医问药，2011年第11卷第12期

[2]许东晖，马海萍，梅雪婷，许实波，鳄鱼的活性物质及其药理作用、保健功效研究进展，中国海洋药物杂志，2007 11，Vol. 26 No.6

[3]Mark E. Merchant、Kent A. Vliet、 Nola McDaniel，等，Comparisons of innate immune activity of all known living crocodylian species（比较现存的各种鳄鱼的先天性免疫活性），Comparative Biochemistry and Physiology， Part B 143 （2006） 133-137