酒鬼酒窖池酒醅芽孢杆菌的系统发育分析和胞外酶学特征

杨玉婷，黎有有，吴秋蕾，樊 林，刘 荷，赵 湖，贺建武，刘祝祥，陈义光

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首416000； 2.酒鬼酒股份有限公司,湖南吉首416000)

白酒是我国特有的一种蒸馏酒，是世界六大蒸馏酒之一，由淀粉或糖质原料制成酒醅或发酵后经蒸馏而得。所谓“千年老窖万年糟，酒好需得窖池老”，窖池中富含多种微生物和微量元素，对于白酒质量和风格的形成起着决定性的作用[1]。酒鬼酒在秉承湘西传统小曲酒生产的基础上，大胆吸纳中国传统大曲酒生产工艺的精髓，将小曲酒生产工艺和大曲酒生产工艺巧妙融合，待小曲培菌糖化完成后，将糖化谷类原料进行配糟、加大曲，入泥池续糟发酵。由于糖化料的加入，使参与窖内发酵的微生物种类、数量、活性等都发生了显著的变化，与浓香型白酒窖内发酵有很大的区别，这种独特的生产工艺使酒鬼酒集浓、清、酱三大香型于一身，具备独特的馥郁香型[2]。

据文献报道，芽孢杆菌在白酒的酿造过程中起着重要的作用。在白酒生产酿造微生物细菌中，优势菌为芽孢杆菌属（Bacillus）[3-9]。白酒酿造过程中，芽孢杆菌参与了酿造的各个环节，不仅分泌淀粉酶等水解酶类，参与酿酒原料中大分子物质的分解，而且是白酒香味物质的主要产生者。以茅台为代表的酱香型白酒采用高温制曲，并在入窖发酵前有特殊的堆积开放发酵工艺，其主要的生香微生物为耐高温好氧芽孢杆菌[10-11]。本研究选取酒鬼酒窖池成熟酒醅，用纯培养法分离其中的芽孢杆菌，采用基于16S rRNA基因序列的系统发育分析法研究这些分离菌株的多样性，并对胞外酶学特征进行观察，为深入了解酒鬼酒独特馥郁香型的形成原理和酒鬼酒酿造工艺的进一步优化提供理论和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂

样品：酒鬼酒生产使用窖池成熟酒醅。

仪器设备及耗材：高压灭菌锅（MLS-3780，SANYO）；生物安全柜（BSC-04IIB2，苏净安泰）；恒温培养箱（IS-RDD3，CRYSTAL）；恒温震荡培养箱（IS-RDVL，CRYSTAL）；显微镜（AB210-T，Motic）；冷冻干燥仪（HETOLL1500，捷克）；离心机（Centrifuge-5424，Eppendorf）；PCR扩增仪（TC-4000，TECHNE）；凝胶成像仪(1600R，Tanon)；电泳仪（Powerpac-HV，BIO-RAD)；DNA 纯度检测仪（Biophotometer，Eppendoff）；细菌 16S rRNA 基因PCR扩增所用酶、引物和试剂购自上海生物工程有限公司（Sangon Biotech）等。

1.2 培养基

共采用以下2种培养基为分离和纯化培养基，均加制霉菌素100 mg/L抑制霉菌生长，加10%酒鬼酒酒醅浸汁配制，倒平板用于分离：

（1）营养琼脂(nutrient agar,NA)：蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，酒鬼酒酒醅浸汁100 mL，水900 mL，pH7.2～7.4。

（2）LB（Luria-Bertani）agar（LA）：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，酒鬼酒酒醅浸汁100 mL，水900 mL，pH7.0。

酒醅浸汁制备：根据采样情况，从每份样品中取出等额量酒醅，混合均匀，称取1000 g，加去离子水2000 mL，常规灭菌30 min，3层纱布过滤，滤液即为酒醅浸汁，4℃保存备用。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集与处理

采用5点法对酒鬼酒的酒醅进行采集，自上而下，按3层分别采集，同一层面按中心部和周边部5点取样，周边样点离窖池壁20 cm。无菌密封，4 h内带回实验室进行分离。每份样品混匀去杂，各取50 g用灭菌信封包裹，室温自然风干14 d。风干样品110℃加热处理1 h，研碎混匀，每份样品取10 g混匀成一个混合样品。取10 g混合样，置于已灭菌盛有90 mL去离子水和玻璃珠的三角瓶中，15℃、180 r/min振荡30 min，制成10-1样品原液，然后做10倍梯度稀释至10-7。

1.3.2 菌株分离

取200 μL 10-4～10-63个梯度稀释液涂布NA和LA平板，倒置在28℃恒温培养箱中进行培养7～14 d。菌落计数后，挑取单菌落用相应培养基进行四分体划线纯化4～5次，所得纯培养物制成冻干牛奶管，并接种于相应培养基斜面，于4℃保存备用。

1.3.3 表型特征观察

菌株的菌落形态、细胞显微形态、芽孢观察及胞外酶学特性观察按照《常见细菌系统鉴定手册》推荐的方法进行[12]。

1.3.4 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析

细菌基因组DNA的提取、16S rRNA基因的PCR 扩增按Hernán-Gómez等[13]使用的方法进行。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生物工程有限公司进行序列测定。根据所测序列结果，在EzBioCloud's Identify Service[14]和 NCBI网站运用Blast搜索程序从GenBank/EMBL/DDBJ等公共数据库进行相似性搜索，调取与其相似性高的相关典型菌株的16S rRNA基因序列组成序列集，用Clustal W[15]软件进行序列多重比对，使用BioEdit软件[16]进行序列剪辑，根据Kimura[17]模型估算系统进化距离矩阵，用MEGA4软件包采用邻接法(Neighborjoining method)进行聚类分析和系统进化树构建[18]。重复取样1000次进行自展值(bootstrap value)分析，以评估系统进化树的拓扑结构稳定性[19]。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

表1 分离自酒鬼酒窖池酒醅芽孢杆菌菌株的形态特征

根据菌落大小、形态、颜色等特征，挑取分离平板上的单菌落进行四分体划线纯化，从本次采集的样品中共分离到104株细菌菌株。再根据细胞形态和产芽孢特征，去除部分冗余，选定28株代表性芽孢杆菌进行进一步研究（表1）。

2.2 系统发育分析

基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果表明，这28株芽孢杆菌代表性菌株具有较高的类群多样性和物种多样性，分属于细菌域（Bacteria）厚壁菌门（Firmicutes）的2个科（Bacillaceae、Paenibacillaceae）的 3 个属（Bacillus、Brevibacillus、Virgibacillus），分为10个物种。芽孢杆菌属（Bacillus）占绝对优势，共26株（92.9%）；其余2株JSM 161009和JSM 166025分属于枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）和短芽孢杆菌属（Brevibacillus）（表2）。

表2 分离自酒鬼酒窖池酒醅芽孢杆菌菌株的系统发育分析

2.3 分离菌株胞外酶学特征

对酒鬼酒窖池样品中分离纯化得到的28株代表性芽孢杆菌进行产淀粉酶、酯酶、明胶酶和脲酶活性观察。结果表明，至少产生1种酶的菌株共27株，占测试菌株的96.4%。其中有20株（71.4%）对淀粉水解作用阳性，19株（67.9%）对明胶有水解作用，27株（96.4%）对尿素有水解作用；有21株（75.0%）对4种吐温（20、40、60、80）之一水解阳性，其中有 3株（JSM 161009、JSM 163017、JSM 168019；10.7%）对4种吐温均有水解作用（表3）。在28株受试菌株中，有8株（JSM 161009、163010、163017、166014、167011、167021、168017、168019）水解酶谱较广（表3）。

系统发育分析结果表明，这8株水解酶谱较广的菌株均属于芽孢杆菌科（Bacillaceae），其中1株（JSM 161009）属于枝芽孢杆菌属（Virgibacillus），其他7株均属于芽孢杆菌属（Bacillus）（表2、图1）。

3 讨论

本实验以酒鬼酒窖池酒醅为研究对象，分离纯化其中的芽孢杆菌，进行系统发育分析和胞外水解酶学特征观察。结果表明，分离纯化筛选所得到的28株代表性芽孢杆菌属于厚壁菌门（Firmicutes）的2个科（Bacillaceae、Paenibacillaceae）的3个属。菌株JSM 161009属于枝芽孢杆菌属（Virgibacillus），JSM 166025属于短芽孢杆菌属（Brevibacillus），其他26株皆属于Bacillus。高温大曲中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）与酱香香气的形成有着非常密切的关系[20]，张荣[21]筛选得到的产酱香细菌属于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。本次实验没有分离到地衣芽孢杆菌，但分离得到了枯草芽孢杆菌和其他7种芽孢杆菌属（Bacillus）菌株，以及枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）和短芽孢杆菌属（Brevibacillus）各一种。这些结果说明酒鬼酒窖池中芽孢杆菌类群多样性和物种多样性较高。我们进一步对这28株菌株进行产胞外水解酶分析，结果表明，这些芽孢杆菌菌株普遍能产生多种胞外水解酶。在酿造发酵工艺中，淀粉酶对酿造原料进行糖化[22]，酯酶是形成传统发酵产品风味物质的基础[23]，明胶酶对酒体澄清起着重要作用[24]，脲酶能降低酒中EC含量[25]。本次实验所筛选到的芽孢杆菌在酒鬼酒的酿造形成过程中究竟起着怎样的具体作用，对酒鬼酒独特的馥郁香型的形成有哪些贡献，值得进一步研究。

表3 分离自酒鬼酒窖池酒醅芽孢杆菌的胞外酶学特征观察

图1 基于16S rRNA基因序列构建的分离自酒鬼酒窖池酒醅水解酶谱较广的8株芽孢杆菌的系统发育树