冷冻切片常见问题的探讨及应对措施

郑建华 邹泽阳

【摘 要】目的：探讨冷冻切片制作过程中常见问题及应对措施，以提高冷冻切片质量。方法：规范各个环节，按照组织特点采取相应处理方法。结果：经光镜观察切片，切片组织切面完整，厚薄均匀，效果良好，所制切片色彩鲜艳，对比清晰。结论：高质量冰冻切片的关键因素是取材、冷冻的温度和时间、切片的技巧、固定及染色方法。

【关键词】病理技术；冷冻切片；常见问题；应对措施

【中图分类号】 R249 【文献标志码】

A 【文章编号】1005-0019（2018）11-294-01

冰冻切片是一种借助低温恒冷条件，使新鲜组织迅速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法[1]，因其操作快捷、简便，已常规应用在手术中快速病理诊断，方便手术医师制定手术方案。与常规石蜡切片的诊断相比，局限性和难度更大，因时间受限，组织未经固定、脱水等前期处理，细胞形态与常规石蜡切片有着一定的差异，往往易出现冰晶、细胞肿胀、组织形态结构不清等现象，直接影响快速病理诊断的及时性及准确性，从而易出现误诊和漏诊，这就要求技术人员必须制作出高质量的切片，满足诊断要求。笔者经过多年的实践工作的经验积累，根据我院以妇科肿瘤和乳腺疾患为主的标本特色，总结出了冷冻切片制作过程中常见的一些问题及应对措施以提高冷冻切片制作质量，现归纳如下。

1 冷冻切片的制作

1.1 取材 由病理医师取材，通常选取具有代表性的病变组织1-2块，如有需要可适量增加取材块数。组织的大小应适宜，一 般在1.5 cm X1.5 cm×0.3 cm，如有黏液、钙化及骨组织则先行去除。体积较大的卵巢肿瘤常出现大量坏死，尽可能少取坏死区，乳腺送检淋巴结标本应尽量剔除脂肪组织。

1.2 速冻 将取材组织放置在滴有包埋剂的冰托上使组织快速冷冻，组织要尽量放平整。切片机的基础温度根据我科常见冷冻标本类型一般置于一20℃，收到标本后根据根据不同组织进行调整（见表1）。

1.3 切片 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，将组织修平。调好预切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤維多细胞稀的稍微厚切，一般在5-10um（见表1）我科通常以5um厚度切片。用毛笔将切片展开，贴附于载玻片上。

1.4 固定 切片后将载玻片及时放人固定液中，以避免细胞核退变，着色力下降、结构模糊不清等现象的产生[2]。固定液的选择要根据冷冻切片的特点，首先要保持组织细胞原有结构不被破坏，染色鲜艳，结构清晰；其次是渗透力要强而迅速。固定液种类繁多，性能各异，应重视固定液的选择和固定速度。此外组织的固定还与组织成分和醛的浓度、pH值、渗透力、温度及浸入组织的速度有关。

1.5 染色 苏木精染液1 min，稍水洗；0.5%盐酸乙醇分化数秒，稍水洗；1%氨水返蓝数秒后水洗；0.7%伊红染液10 s，稍水洗；80%乙醇、 95%乙醇、无水乙醇I、无水乙醇Ⅱ、二甲苯I、Ⅱ各 30s，擦净标本周边二甲苯后用中性树胶封固。

1.6 切片质量评定标准 根据镜下细胞的收缩程度及切片的染色质量进行评判[3}（见表2）。

2 冰冻切片常见问题及应对措施

2.1 出现冰晶 冰晶是组织在冷冻固化过程中，由于冷冻缓慢，冷冻时间过长，使细胞质和组织间隙内未结合的水逐渐析出形成。应对措施：取材大小、厚薄要适宜，过大过厚影响冷冻速度；取材时避免混入水分；冷冻时间要短，只有速冻才能减少组织内的冰晶形成，对容易形成冰晶的肌肉、脑组织应采用干冰或液氮冷冻，以减少冰晶的形成。[4]

2.2 脱片 偶见于坏死组织或含水量大的组织，如子宫肌瘤黏液变性时。应对措施：首先切片前用吸水纸吸去多余水分，切片不能太厚，其次切片固定后用吹风机吹干再染色。

2.3 组织块脱落 组织块脱落多因组织与冷冻头冻结不紧，稍微受外力的作用便脱落。此外冷冻头上有用过的包埋剂残留及修整组织块时进度太大都可导致组织块从冷冻头上脱落。应对措施策：用过的冷冻头要及时清洗干净备用。修整组织时应循序渐进，不可操之过急。[5]

2.4 切片不全或不能切片 主要原因是组织脂肪及坏死组织过多、冷冻时间过长、冷冻头温度不足。应对措施：冷冻温度应随组织块类型不同进行调节，组织内含过多的脂肪或坏死组织脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些，当活组织达到所需的温度时，其还比较软，从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间[6]。对于乳腺癌术中前哨淋巴结进行冷冻前一定要剔除周围的脂肪组织。冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25℃～-30℃左右，如温度过高则会导致切片困难。

2.5 切片皱缩或卷缩 主要常见于切片刀锋变钝及防卷板粘有异物，防卷板的作用是防止切片卷缩，但若粘有异物，切片时组织会被挤压而缩在一起。此外防卷板与刀锋的位置不协调、组织块包埋不完全，缺乏支撑作用都会引起切片皱缩或卷缩。应对措施：注意及时更换刀片；保持防卷板的清洁，每做一例冷冻切片，均应将刀口及防卷板拭擦干净，防止切片的污染和切片皱缩。

2.6 细胞染色过浅或模糊不清 适当延长固定、染色时间，当苏木精染色力下降时及时更换。脱水流程不能太快并定期更换脱水液。

2.7 产生空洞 原因是由于缓慢的冷冻使水分子向细胞间疏松区域游离、聚集，然后凝结成冰，当切片快速放人固定液后，冰融化留下了空洞[7]。应对措施：缩短冷冻时间，吸去多余水分。

3 冷冻切片操作规范与注意事项

3.1 术中冰冻组织切片前不能固定 如已经福尔马林固定的组织需补做冷冻切片，在常规取材后，用滤纸吸干周围水分，置包埋托上加包埋剂，入液氮后取出，置于冷冻切片机冷冻台上片刻，修切组织，切片，吹干，不需固定，直接染色[8]。

3.2 组织取材大小要适宜 组织过大，切片的阻力过大，易产生皱折，刀痕，造成组织崩解，增加切片难度，影响病理诊断。反之，组织过小，破碎，则不宜将组织包埋在同一个 水平面，影响切片操作，造成漏诊或误诊[9]。

3.3 组织标识要明确，重点部位的组织应该标识明确，明确组织的包埋方向。可疑肿瘤的范围，淋巴结和带有包膜的组织，需要将整个切面暴露且含有整个包膜的存在。

3.4 包埋剂的量要适宜，过多损伤切片刀，过少起不到包埋作用。

3.5 冰冻时间太久不宜立即切片。

3.6 用于附粘的载玻片不能存放于冷冻处，于室温存放即可。

3.7 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净。

4 讨论

快速冰冻诊断的意义在于确定病变性质（如判断组织的良恶性），了解惡性肿瘤的扩散情况，确定肿瘤手术切缘情况。总结起来就是快和准，在组织的厚度与大小确定后，技术员应更多地摸索适合 本科室冷冻切片机的冷冻时间与温度，在确保冷冻切片质量的前提下，尽可能缩短制片时间[10]。制作良好的冷冻切片必备的三个条件（1）性能良好的冷冻切片机；（2）对冷冻切片技术掌握较好的技术员；（3）具有相当临床病理诊断经验、经过一定训练的病理医生（副主任医生级别以上），对冷冻切片造成的人为假象应有一定的认识[11]。总之，选择合适的温度与时间是保证冷冻切片质量的重要环节之一，应根据本科的设备与条件制定最佳的冷冻制片方案。一张高质量的冰冻切片，不仅要掌握重要的技术操作，还要高度的责任心，不断总结经验和教训，逐渐提高冰冻切片质量，缩小与常规石蜡切片的差距，减少人为假象，为正确的病理诊断提供有力支持与保障。

参考文献

[1] 黄书华，王丽萍，蒋记心.快速冰冻切片制作方法及经验[J].大家健康（上旬版），2016，10（5）：82-83.

[2] 胥维勇，杨群.影响冷冻切片质量因素的分析[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2003，12（2）：228-229.

[3] 胡锦林，王灿铭，郭振英.固定液对冷冻切片质量的影响[J].临床与实验病理学杂志，2015，（6）：706-707.

[4] 范慧，陈立华，刘宇.冷冻切片的制作体会及常见问题分析[J].诊断病理学杂志，2008，15（2）：134，138.

[5] 孙丽萍.冷冻切片的常见问题与对策[J].诊断病理学杂志，2011，18（6）：475

[6] 骆新兰.冷冻切片常见问题分析与预防[J].临床与实验病理学杂志，1999，15（4）：356-357.

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[8] 张意平，肖同浩.用已固定组织制作冷冻切片体会[J].临床与实验病理学杂志，2001，17（5）：408-408.

[9] 马恒辉，周晓军.如何提高冷冻切片的技术水平[J].临床与实验病理学杂志，2011，27（1）：90-92.

[10] 王颖，范幼奇.提高卵巢肿瘤冷冻切片质量的体会[J].临床与实验病理学杂志，2008，24（3）：373.

[11] 仇玲玲，翟梅娟，黄斌，黄雅萍.冷冻切片1 000例制作的体会[J].肿瘤研究与临床，2006，18（10）：710-711.