不同ELISA试剂盒与PCR法检测鸡新城疫病毒的比对试验与研究*

孟凯 ，邵明辰 ，袁小远 ，张玉霞 ，王友令 **

（1.山东省农业科学院家禽研究所，山东 济南 250100；2.山东鲁南牧工商有限公司，山东 滕州 277500）

鸡新城疫（Newcastl Disease，ND）是禽类的一种急性、高度接触性及致死性烈性传染病，是当今世界范围内最严重的家禽传染病之一。亚洲是本病的重灾区，因此本病又称为亚洲鸡瘟，可造成大面积的流行，本病的大面积流行与候鸟的迁徙是密不可分的，由于人类无法控制这种候鸟的迁徙行为，因此本病能跨区域跨国传播，每年造成的经济损失非常巨大[1-2]。

由于在临床上多见于送检新城疫的死鸡，而抗体检测不适用于死鸡，因此需要对病料进行新城疫病毒的检测。在新城疫病毒的检测中，常用方法有PCR、荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫金标试纸条等[3-6]。由于ELISA具有快速、准确、简便的优点，加之ELISA具有可批量检测及自动化检测的优势，其更适合于大规模检测和便于标准化，ELISA技术已越来越被广大实验室所采用。本研究中，我们选取了A、B、C三家公司的商品化ELISA新城疫病毒检测试剂盒对50份临床疑似新城疫病料进行检测，分析了不同公司生产的ELISA试剂盒检测结果与PCR法检测结果的相关性，比较了A、B、C三家公司生产的ELISA试剂盒检测结果的阳性符合率、阴性符合率、阴阳性总体符合率、试剂盒价格以及试验时长等数据，以期筛选出既准确实用、操作简便，又能最大程度节约检测成本的适用于临床大规模鸡场新城疫病毒检测的ELISA试剂盒。

1 材料与方法

1.1 试剂材料 鸡新城疫病毒La Sota疫苗株购自中国兽药监察所；50份临床疑似新城疫病料均来自潍坊市寒亭区某一发病鸡场；鸡新城疫病毒ELISA检测试剂盒分别购自A、B、C三家生物科技有限公司，其中A公司生产的鸡新城疫病毒ELISA检测试剂盒为国外进口产品，B公司和C公司生产的鸡新城疫病毒ELISA检测试剂盒为国产产品；病毒RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；AMV反转录酶、dNTP为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 PCR检测 根据GenBank已发表的鸡新城疫病毒F基因的保守核苷酸序列，应用DNA Star软件和Primer 6.0生物软件设计一对特异性引物。其中F：5'-TGCACGATTCAATGACCGGA-3' ；R：5'-GTGCAGACCAAATCCTCCGA-3' ；目的条带大小为200bp。引物由华大基因公司合成，储存液浓度为50pmol/μl，置于-20℃保存备用。参照病毒RNA提取试剂盒说明书进行病毒RNA提取，参照AMV反转录试剂盒说明书制备cDNA。PCR 反 应 体 系 如 下 ：94℃ 5min；94℃ 30s，53℃30s，72℃ 1min，35 个循环；72℃ 10min。 阳性对照为新城疫病毒La Sota疫苗株，阴性对照为SPF鸡胚尿囊液。反应产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。观察结果并记录。

1.2.2 ELISA检测 其操作方法分别依照A、B、C三家公司的新城疫病毒ELISA检测试剂盒说明书进行。

1.3 ELISA方法和PCR方法的检测符合率分析 以PCR为基础，PCR检测结果为阳性的样本用ELISA方法得出的阳性率便为二者的阳性符合率，PCR检测结果为阴性的样本用ELISA方法得出的阴性率便为二者的阴性符合率，用两种方法检测同为阳性或阴性的样本占检测总样本的比率为二者的总体符合率。

1.4 待检样品的检测 采用A、B、C三家公司的禽新城疫病毒ELISA检测试剂盒分别对50份临床样品（其中34份为PCR检测阳性，16份为PCR检测阴性）进行检测，利用统计学方法对检测结果进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 ELISA方法对50份临床样品的检测结果 按照新城疫病毒ELISA检测试剂盒提供的临界点判定值，采用 A、B、C三家公司的禽新城疫病毒ELISA检测试剂盒分别对50份临床样品进行检测，结果见表 1、表 2、表 3。

表1 A公司ELISA检测试剂盒对临床样品的检测结果

表2 B公司ELISA检测试剂盒对临床样品的检测结果

表3 C公司ELISA检测试剂盒对临床样品的检测结果

由表1、表2、表3可以看出，A公司生产的ELISA试剂盒与PCR方法的阳性符合率达到了94.1%，阴性符合率为87.5%，阴阳性总体符合率为92%；B公司生产的ELISA试剂盒与PCR方法的阳性符合率为91.2%，阴性符合率为93.8%，阴阳性总体符合率为92%；C公司生产的ELISA试剂盒与PCR方法的阳性符合率为85.3%，阴性符合率为81.3%，阴阳性总体符合率为84%。

2.2 三家公司新城疫病毒ELISA检测试剂盒的价格及平均试验时长 A、B、C三家公司的新城疫病毒ELISA检测试剂盒价格及试验时长如表4所示。

表4 ELISA检测试剂盒价格及试验时长

3 讨论

目前，在临床上已经有多种试验方法用于鸡新城疫病毒的检测，其中最为常见的为ELISA和PCR试验方法，对于养鸡场和养殖户来说，掌握一种适合自己的检测方法就可以节约鸡新城疫病毒检测的成本，并能够实时监测鸡群健康状况，在临床上对鸡新城疫疾病的防控起到很好的预防效果。

结合本试验所得出的数据，可以看出A公司生产的鸡新城疫病毒ELISA检测试剂盒与PCR方法的阳性符合率最高，达到了94.1%；阴性符合率为93.8%，阴阳性总体符合率为92%，平均试验时长为2.5h，试验时间大大缩短，其产品性能在三家公司中最好，但其试剂盒的价格为1800元，远远高于其他两家公司的产品，考虑到成本问题，A公司生产的ELISA试剂盒不适于在临床上大规模的推广；其次是B公司生产的新城疫病毒ELISA检测试剂盒，该试剂盒的检测结果与PCR方法的检测结果的阳性符合率为91.2%，阴性符合率为87.5%，阴阳性总体符合率为92%，产品性能稍低于A公司产品，虽然试验时间较A公司产品略长，但其价格为1300元，价格优势明显；C公司生产的试剂盒的价格虽然最低，但其与PCR方法的阳性符合率仅为85.3%，阴性符合率为81.3%，阴阳性总体符合率仅为84%，其产品性能均与A、B两家公司的产品存在差距，因此也不适于临床上的推广应用。

本试验中，通过比较A、B、C三家公司生产的鸡新城疫病毒ELISA检测试剂盒的性能、价格及试验时长等数据，可以看出，B公司生产的ELISA检测试剂盒价格优势明显且产品性能完全能够满足临床需要，适于临床样本的大规模检测。