MAGE-D1对大鼠牙胚来源外胚间充质干细胞增殖迁移能力的影响

杨 琨，李 骏，丰奇昊，沈梦杰，陈谦谦，罗雅馨，刘 琪，温秀杰

(1.遵义医学院附属口腔医院 牙周科，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属口腔医院 种植科，贵州 遵义 563099；3.陆军军医大学大坪医院 口腔科，重庆 400000)

颅神经嵴(cranial neural crest，CNC)来源的外胚间充质干细胞(ecto-mesenchymal stem cell)，是除牙釉质以外所有牙齿组织的形成细胞[1]。在牙齿的发育过程中，这些细胞迁移至上下颌突，与牙源性上皮相互作用形成牙囊和牙乳头，进而分化为多种牙齿组织发生细胞，经过一系列的分化机制，形成牙槽骨、牙骨质和牙本质等组织[2]。来源于颅神经嵴的EMSCs在颌面部及牙齿的发生发育过程中起到非常重要作用。而EMSCs的增殖及迁移能力以及上皮—间充质的相互作用是目前牙发育研究乃至牙组织工程研究所关注的重点。

MAGE-D1同样称为NRAGE或者Dlxin-1，属于MAGE家族蛋白[3-4]。一共有32个MAGE家族的蛋白被检测出，但是这个家族正常生理学功能仍然不清楚[5]。hMAGE-A、hMAGE-B和hMAGE-C等亚家族成员只表达在男性精子细胞及胎盘中[5]，在许多正常组织中属于缄默基因[3,5]。然而许多MAGE家族成员表达在多种肿瘤细胞中，因此对其抗肿瘤免疫治疗引起了特殊的兴趣[5]。hMAGE-D亚家族在许多正常组织及处于不同的表达水平[3,6-7]。mMAGE-D1主要表达在鼠科动物大脑及卵巢中[8]，表明MAGE-D1在雌性生育组织中起到非常重要的作用。前期研究表明，MAGE-D1是细胞凋亡、转录、细胞周期进程、细胞黏附及血管生成的调控因子[3-4,9-10]。目前大量的研究都表明，MAGE-D1在胸腺癌细胞[11]、胰腺癌细胞[12]、黑色素瘤细胞[13]及食管癌细胞[14]中的增殖迁移及侵袭生物学过程中存在非常重要的作用，但是我们感兴趣的是，上皮-间充质转化这一牙发育的基本过程可能也受到MAGE-D1的调控，特别是颅神经嵴来源的外胚间充质干细胞，能够参与上皮-间充质转化过程，并且进一步影响牙及颌面部组织的发育。我们已经证明在大鼠的外胚间充质干细胞中，MAGE-D1能与p75NTR结合从而影响细胞的骨向分化能力[15]，但在此过程中，外胚间充质干细胞骨向分化的影响是否会是MAGE-D1干预的细胞增殖迁移能力改变的作用？是本研究着重解决的问题。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 DMEM-F12培养基、胰酶(Gibco,美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；鼠抗人CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166、p75NTR单克隆抗体(Abcam,美国)；MAGE-D1单克隆抗体(Bioworld，美国)；细胞RNA提取试剂盒、Real Time-PCR mix试剂盒(Takara，日本)；细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime，上海)；β-catenin鼠单克隆抗体，E-cadherin鼠单克隆抗体，GAPDH鼠单克隆抗体，山羊抗兔lgG(Abcam，美国)；罗丹明山羊抗小鼠IgG(中杉金桥，北京)；MAGE-D1 siRNA引物(Sangon，上海)；lipofectamine 2000(Thermo Fisher，美国)。

体式显微镜、倒置相差显微镜以及照相系统(OLYMPUS，日本)；流式细胞分析仪(Beckmen Coulter，MoFloAstriosEQ美国)；Real Time PCR仪器(Applied Biosystems,7500 FastDX美国)。

1.2 大鼠E19.5 d牙胚来源外胚间充质干细胞分离培养及鉴定 SD大鼠胚胎19.5 d颌突外胚间充质干细胞(E19.5d EMSCs)：在大鼠孕E19.5 d午间以40 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠，取出数个胚胎，置入6 cm培养皿，剥离羊膜后头身分离，后分离上下颌，于体式显微镜下固定点位，剥开软骨组织，眼科镊取出牙胚组织，置入装有5 mL PBS的15 mL离心管，摇晃清洗后离心，加入1 mL1%Ⅰ型胶原酶置入孵箱内消化30 min，中和离心1 000 rpm，3 min，去上清后将组织均匀平铺于6 cm培养皿中，加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM-F12培养液约4～5 mL，置于含5%CO2的恒温箱中静置贴壁培养，37 ℃，约24 h后显微镜下可见细胞从组织块中爬出并贴壁生长。

取生长状态良好的第3代E19.5d EMSCs，常规消化离心后，稀释并计数，细胞数量为5×105个/1.5 mL EP管，加入已配制好的含3% FBS的PBS重悬细胞，加入CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166和p75NTR单克隆抗体2 μL，4 ℃冰箱避光孵育12 h(过夜)，12 000 rpm 离心5 min，加入单抗相对应的荧光二抗避光孵育2 h，无需荧光的加入等量PBS。加入含3%FBS的PBS混合均匀溶液，吹匀，3% FBS 的PBS清洗，12 000 rpm离心5 min，清洗2～3次后加300 μL 3% FBS 的PBS，重悬，流式细胞仪检测各组细胞表面分子。实验重复3次。

1.3 MAGE-D1siRNA转染 取第3代，E19.5d EMSCs 5×104个细胞接种在24孔板上，待24 h后汇集率至70%～90%，0.5 mL 10%FBS DMEM-F12和抗生素的DMEM(或Opti-MEM，其他培养基)细胞培养基更换继续培养12 h。混匀lipofectamine2000试剂，用50 μL无血清的DMEM稀释1 μL lipofectamine试剂轻轻混匀，室温放置5 min；将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合；轻柔混匀，室温放置20 min，以便形成siRNA/lipofectamine复合物，加入孔板中，孵育12 h后，除去复合物，更换新鲜的10%FBS DMEM-F12培养基，Real-Time PCR检测转染效果(图4 A)，转染细胞获得后进行下一步实验。

后续实验的细胞分为两组：对照组(Control)和MAGE-D1 siRNA组(MAGE siRNA-EMSCs)，其中对照组为E19.5 d牙胚来源外胚间充质干细胞，MAGE-D1 siRNA组为MAGE-D1siRNA转染的细胞(MAGE siRNA-EMSCs)。

1.4 CCK8检测两组细胞增殖能力变化 分别取生长状态良好的第3代E19.5d EMSCs及MAGE siRNA-EMSCs，按细胞密度为1×103个/孔接种，测7d增殖曲线，每天作5个复孔，每孔细胞培养基为200 μL含 10%FBS 的DMEM-F12。24 h后，第1天各组细胞加入20 μL CCK8，反应1 h，酶标仪检测450 nm吸光度值，检测7 d，绘制两组细胞连续生长曲线。实验重复3次。

1.5 划痕实验法检测两组细胞迁移能力的变化 用Marker笔在6孔板背侧划线，1 cm一道横向标记，第3代E19.5 d EMSCs和MAGE siRNA-EMSCs调整细胞密度后铺板，用200 μL枪头垂直背侧横向标记划痕，置于37 ℃，5%CO2，饱和湿度孵箱，于0、72、120 h后照相。每个视野用imageJ软件做出6条横线测量横线间最近两个细胞的距离，其平均值为72～120 h中48 h时间的各组细胞的迁移量。实验重复3次。

1.6 Real Time-PCR检测两组细胞MAGE-D1、β-catenin、E-cadherin的mRNA表达 对照组和MAGEsiRNA-EMSCs组细胞培养3 d后进行细胞收集，按TRIzol说明书方法提取EMSCs总RNA，并用反转录试剂盒合成cDNA。参照GenBank数据库，基因号分别为：MAGE-D1(ID:84469)、β-catenin(ID:84353)、E-cadherin(ID:83502)、GAPDH(ID:24383)，以Primer primer 5.0计算机软件设计引物；以GAPDH为内参照，反应体系：premix 10 μL、dye 0.4 μL、ddH2O 6.6 μL、上下游引物各0.5 μL、样本模板2 μL；反应条件:95 ℃ 5 min、 94 ℃ 30 s 、65 ℃ 30 s、40个循环。实验重复3次，所用引物均由上海生工公司合成，各引物基因序列见表1。

表1引物基因序列

基因引物序列GAPDH正向:5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'反向:5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'MAGE-D1正向:5'-GCCAGATACCACCAGAATGC-3'反向:5'-TCAACCCAGAAGAAGCCAAT-3'β-catenin正向:5'-GCTGACCAAACTGCTAAATGACGA-3'反向:5'-TGTAGGGTCCCAGCGGTACAA-3' E-cadherin正向:5'-AGCCAGACACATTCATGGAAC-3'反向:5'-TCGTTATCCGAGATTGAGA-3'

1.7 蛋白质印迹法检测两组细胞MAGE-D1、β-catenin、E-cadherin蛋白水平 取培养3 d后的对照组和MAGEsiRNA-EMSCs组细胞，用碧云天Western及IP细胞裂解液进行总蛋白提取；用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量测定；SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，免疫反应；最后进行化学发光反应检测MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin蛋白的表达。

2 结果

2.1 E19.5d外胚间充质干细胞分离培养 通过组织块法及胶原酶消化法成功获得并培养了E19.5d胚胎时期牙胚来源外胚间充质细胞，细胞形态规则，为间充质干细胞纺锤样形态，呈梭形或多边形(见图1)。

A：E19.5d原代EMSCs；B：E19.5d第三代EMSCs。图1 E19.5d外胚间充质干细胞原代培养与传代培养

2.2 E19.5d外胚间充质干细胞的鉴定 通过流式细胞仪检测E19.5d外胚间充质干细胞表面分子，细胞阳性表达的结果分别为：CD14(92.16%)、CD29(94.53%)、CD44(99.51%)、CD90(95.18%)、CD105(34.22%)、CD146(92.39%)、CD166(98.15%)和p75NTR(88.56%)，细胞阴性表达CD45(0.50%)。

2.3 大鼠EMSCs与MAGE siRNA-EMSCs增殖能力 比较两组细胞7 d增殖曲线，在对照组和MAGEsiRNA-EMSCs组相同培养条件下，对照组增殖能力高于MAGEsiRNA-EMSCs组(P<0.01)，差异有统计学意义(见图2)。

图2 CCK8检测对照组和MAGEsiRNA-EMSCs组细胞增殖能力

2.4 大鼠EMSCs与MAGE siRNA-EMSCs迁移能力 比较划痕实验72 h后，两组细胞都发生迁移，但是MAGEsiRNA-EMSCs组(D)迁移能力较对照组(C)强，至120 h时仍能发现相同情况，计算72～120 h间48 h时间的细胞迁移量平均值，MAGEsiRNA-EMSCs组明显多于对照组(P<0.0001)，差异具有统计学意义(见图3)。

A：0 h对照组；B:MAGEsiRNA-EMSCs组0 h；C：72 h对照组；D:MAGEsiRNA-EMSCs组72 h；E：120 h对照组；F:MAGEsiRNA-EMSCs组120 h；G:两组细胞在72～120 h间48 h的细胞迁移量统计图(***：P<0.000 1)。图3 划痕实验法检测对照组和MAGEsiRNA-EMSCs组EMSCs迁移能力

2.5 大鼠牙胚来源外胚间充质干细胞MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin的mRNA表达 对照组MAGE-D1表达明显高于MAGEsiRNA-EMSCs组(P<0.01)。为深入比较两组细胞迁移能力变化的机制，检测β-catenin,E-cadherin的mRNA表达，对照组E-cadherin表达明显高于MAGEsiRNA-EMSCs组(P<0.05)，β-catenin表达趋势与E-cadherin相反(P<0.01)，差异具有统计学意义(见图4)。

A:MAGE-D1；B:E-cadherin；C:β-catenin。*：P<0.05；**：P<0.01。图4 两组细胞的MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin的mRNA表达

2.6 大鼠牙胚来源外胚间充质干细胞MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin的蛋白水平 培养3 d后的对照组和MAGE siRNA-EMSCs组细胞，两组细胞MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin蛋白表达的变化趋势与其mRNA表达变化结果相一致(见图5)。

图5 两组细胞的MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin的蛋白水平

3 讨论

神经嵴来源的外胚间充质干细胞在牙发育形态形成中存在非常重要的作用。Abe等[16]自人阻生齿未成熟的根尖中获得神经嵴来源的根髓干细胞群。Karbalaie等[17]利用人胚胎干细胞 (human embryonic stem cells，hESCs) 与人乳牙间充质干细胞 (stromal stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED) 共同培养，获得神经嵴来源的细胞。这些结果都表明，在牙和颌面部发育及形成的过程中，神经嵴来源的干细胞在其中扮演的重要角色，因此，我们培养扩增E19.5 d牙胚来源的外胚间充质干细胞作为主要研究对象，以此讨论牙发育过程中关键步骤：上皮—间充质相互转化的可能机制。

在本课题组的前期研究中[18-19]，我们建立了能够代表神经嵴来源干细胞的细胞模型，通过流式细胞表面分子鉴定我们也发现，此牙胚来源的细胞高表达包括p75NTR[15]在内的神经嵴源性及间充质源性的细胞表面标志性分子。本研究培养出的细胞形态观察也可以发现，细胞呈纺锤状或多边形状，具有间充质干细胞的形态。神经嵴来源的EMSCs可以代表胚胎发育一个时期的始祖细胞，研究其参与牙及胚胎发育中的增殖、迁移等作用机制是颌面部及牙发育组织工程的一个重点。

MAGE-D1能与多种胞内胞外蛋白结合并且介导并调控诸如凋亡[20]、转录[21]、细胞周期[22]、细胞黏附及血管化[11]等细胞生理功能。本研究中我们首次讨论MAGE-D1转染对外胚间充质干细胞的增殖、迁移的影响。近年来有大量的证据表明MAGE-D1具有抑制增殖的能力。体外实验HEK293肾上皮细胞系中，MAGE-D1展示出显著的抑制增殖的能力，还包括肝癌HepG2细胞以及人骨肉瘤细胞U2OS[23]。MAGE-D1同样能够与其有同源结构域蛋白necdin反应，necdin是一个潜在的生长抑制因子，并且广泛的表达在有丝分裂后期细胞包括神经元和骨骼肌细胞，两者结合能够诱导生长停滞[24]。Wen等[23]发现MAGED1通过p53依赖通路抑制HEK203、U2OS及HepG2细胞生长。细胞周期停止发生在G2/M及G1期。还有学者发现MAGE-D1在交感神经前体细胞中通过结合p75NTR介导G1期停滞[25]。国外研究报道MAGE-D1能够通过JNK/C-JUN通路诱导caspase激活以及细胞死亡[26]。也有研究发现MAGE-D1并不能诱导HEK203,U2OS及HepG2的凋亡[23]。唯一合理的解释是：MAGE-D1在不同的细胞中存在不一样的功能。大多数的研究都集中在肿瘤细胞的研究中，而本研究突破以往理念的束缚，在外胚间充质干细胞中调控MAGE-D1，观察其对细胞生理过程产生的影响，而从增殖及划痕实验来看，虽然人为下调MAGE-D1对EMSCs的增殖能力存在抑制作用，这与在肿瘤细胞中的研究结果不尽相同，但是其迁移能力存在显著提高，因此，我们更深入探讨了影响这种迁移能力可能存在的机制。

外胚间充质干细胞的迁移和增殖对牙发育过程中上皮—间充质转移和新陈代谢非常重要，涉及到很多基因调控着很多过程。E-Cadherin 作为细胞间的胶体，介导同种钙依赖的细胞与细胞间的黏附，它的胞浆部分与β-catenin相结合，其能够使黏附复合体相连接到actin细胞骨架上[27]。两者形成的细胞黏附系统被称为“侵袭抑制系统”。国外研究者表明，WNT3a可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞β-catenin的细胞核内移位，并高表达激活WNT信号通路，促进细胞的迁移[28]，重组小鼠釉原蛋白也存在相同功能[29]。MAGE-D1能够促使β-catenin由细胞膜分布转移到细胞质和细胞核中，破坏E-cadherin和β-catenin的结合，抑制了E-cadherin和β-catenin介导的钙离子依赖的细胞与细胞之间的粘附。过表达NRAGE可诱导β-catenin发生O-乙酰氨基糖基化修饰，促进β-catenin向细胞核内转移，增强β-catenin与DNA的结合能力。但由于糖基化的存在，β-catenin与Pygopus的结合受到抑制，进一步抑制了WNT信号通路[30]。本研究中，划痕法显示，MAGE-D1的下调促进了外胚间充质干细胞的迁徙。RealTime-PCR检测与Western blot检测结果相一致，下调MAGE-D1后上调了β-catenin表达，下调了E-Cadherin 表达。相似的是，Xue等[9]发现人MAGE-D1通过抑制E-Cadherin/β-catenin复合体能够抑制U2OS细胞间的黏附。还有研究者发现在含氧量正常和缺氧的条件下，MAGE-D1都能够抑制细胞的迁徙侵袭和黏附[10]。MAGE-D1同样被报道能够在体内和体外抑制黑色素瘤和胰腺癌的新陈代谢[12]。

因此，我们发现在牙胚来源的外胚间充质干细胞迁移能力的改变机制中，MAGE-D1可能参与其中并发生重要的作用，研究结果对牙发育上皮—间充质相互转换迁移提供了一定的理论支持，为牙发育组织工程的进一步发展添砖加瓦。然而牙发育过程中涉及到的基因蛋白网络复杂，实现牙发育组织工程化仍然需要大量的基础、转化医学及临床研究，而本团队将继续深入相关研究，加快牙组织工程化进程。