浆细胞样树突状细胞及TLR7 TLR9在BP皮损中的表达及临床意义

朱宁 韩睿 程浩⋆

鲍温样丘疹病（BP）临床表现为青壮年外生殖器部位多发色素性扁平丘疹，组织病理呈低度恶性原位鳞癌表现，本病的发生、发展及复发与人乳头瘤病毒（HPV）尤其是与HPV16、18等高危型感染有关。浆细胞样树突状细胞（pDC）作为机体重要的免疫效应细胞，通过其选择性高表达的Toll样受体7和9（TLR7和TLR9）识别病毒核酸，引起pDC活化、IFN-α和其他炎症性细胞因子的分泌并激活其他类型免疫细胞，从而起到抗病毒感染的作用［1］。研究显示［2］BP患者皮损处存在免疫抑制状态，特别是局部细胞免疫受抑制，造成一系列免疫细胞和相关细胞因子的数量和功能异常有关，但具体机制尚未完全阐明。本文探讨pDC和TLR7、TLR9在BP病毒免疫方面发挥的作用，现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2008年7月至2013年12月浙江大学医学院附属邵逸夫医院36例BP患者的皮损蜡块，均符合BP临床诊断并经组织病理确诊。其中男26例，女10例；年龄21～64岁，平均年龄（33.06±10.38）岁。病程1个月～3年，平均（7.33±8.00）个月。男性皮损部位包括龟头、冠状沟、包皮、阴茎、阴囊；女性皮损部位包括会阴、肛周、阴道口、大小阴唇等。所有病例均排除自身免疫性疾病、病毒性肝炎、结核及糖尿病等可能影响机体免疫力的疾病。本研究经医院和学校伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂 鼠抗人CD123单克隆抗体、兔抗人TLR7多克隆抗体、兔抗人TLR9多克隆抗体（均购自美国Santa Cruz公司），即用型UltraSensitivTM S-P免疫组化试剂盒、二抗（生物素标记的羊抗鼠、羊抗兔）、DAB酶底物显色剂（均购自北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 方法 （1）CD123、TLR7、TLR9的免疫组化染色：分别取36例BP患者局部皮损和皮损旁正常皮肤组织，标本经10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片厚度为4 μm。采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶法（SP法），按照试剂盒说明书操作，常规脱蜡，水化，抗原修复，依次滴加过氧化物酶阻断剂，封闭血清，分别用鼠抗人CD123单克隆抗体、兔抗人TLR7多克隆抗体、兔抗人TLR9多克隆抗体进行免疫组化染色，以PBS代替一抗作为阴性对照，一抗工作液稀释浓度为1：100，生物素标记的二抗，链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，DAB显色，苏木素复染并封片，光镜下观察并判定结果。（2）免疫组化染色结果判定：①CD123+pDC的表达及计数［3］：10×40倍光镜下观察，表皮、真皮内以细胞浆和/或细胞膜着色呈褐色并有树突状突起的细胞为CD1a+LC、CD123+pDC，每张切片随机选取表皮、真皮乳头层为主的5个视野计数CD1a+LC、CD123+pDC细胞数和细胞总数，CD1a+LC、CD123+pDC密度=5个视野CD1a+LC、CD123+pDC细胞总数/5个视野总细胞数。②TLR7、TLR9的表达及半定量计分［4］：10×40倍光镜下观察，以细胞浆和/或细胞膜有棕褐色到淡黄色颗粒着色者为TLR7、TLR9阳性细胞，表达强度采用基于染色强度和阳性细胞百分率的半定量计分法：染色强度计分（A）：3分：棕褐色；2分：棕黄色；1分：淡黄色；0分：未着色；阳性细胞百分率计分（B）：3分：＞66%的表皮细胞着色；2分：33%～66%的表皮细胞着色；1分：＜33%的表皮细胞着色，TLR7、TLR9的表达强度为：A×B。每张切片随机选取5个视野进行阳性细胞观察并予以半定量计分，取平均值作为10×40倍光镜下每个视野内TLR7、TLR9表达半定量计分的平均结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以（）表示，两组样本均数比较采用t检验，相关性分析采用Pearson相关法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BP皮损组织中CD123+pDC的分布与密度 CD123分子主要表达于真皮乳头层的单核细胞，为棕褐色胞浆着色的树突状细胞，结果见图1。BP皮损真皮乳头层中CD123+pDC密度（0.351±0.107）比皮损旁正常皮肤真皮乳头CD123+pDC密度（0.232±0.111）明显增多（P＜0.01），且体积较大，呈多角形，见表1。

图1 CD123+pDC在BP皮损组织和皮损旁正常皮肤组织中的分布与密度（SP×400）

表1 BP皮损组织和皮损旁正常皮肤组织中CD123+pDC的表达比较

2.2 BP皮损组织中TLR7的表达 TLR7在真皮上部表达较强，主要位于胞浆。TLR7在BP皮损真皮内表达强度明显高于皮损旁正常皮肤组织真皮内［（5.083±2.285）vs.（3.611±1.498），P＜0.01］，见图 2、表2。

图2 TLR7在BP皮损组织和皮损旁正常皮肤组织中的表达（SP×400）

表2 BP皮损和皮损旁正常皮肤的真皮组织、表皮组织中TLR7、TLR9的表达比较

图3 TLR9在BP皮损组织和皮损旁正常皮肤组织中的表达（SP×400）

2.3 BP皮损组织中TLR9的表达 TLR9主要定位于细胞的胞浆，以真皮上部为主（4.639±2.072），结果见图3。TLR9在BP皮损真皮内表达强度明显高于皮损旁正常皮肤组织真皮内［（3.278±1.137），P＜0.01］，见表2。

2.4 BP皮损CD123+pDC细胞密度与TLR7、TLR9表达的相关性分析 BP皮损组织中CD123+pDC细胞密度较高，皮损真皮中TLR7、TLR9高表达，皮损组织中CD123+pDC密度与皮损真皮中TLR7表达水平及与TLR9表达水平间均呈直线正相关关系（前者r=0.617，P=0.000；后者 r=0.505，P=0.002），见图 4A、B。在BP皮损旁正常皮肤组织中CD123+pDC细胞密度较低，皮损旁正常皮肤组织真皮中TLR7、TLR9低表达，皮损旁正常皮肤组织中CD123+pDC密度与皮损旁正常皮肤组织真皮中TLR7及与TLR9之间均呈直线正相关关系（前者r=0.617，P=0.000；后者r=0.522，P=0.001）。

3 讨论

pDC是机体免疫系统在抗病毒感染过程中主要产生IFN-α的细胞，能够对多种病毒感染作出应答。人类较多病毒性疾病均存在不同程度的pDC数量和功能改变，但不同的研究结果存在一定的争议。

目前国内外关于HPV感染相关的疾病中pDC的免疫作用和地位研究报道甚少，特别在与高危型HPV16、18感染关系密切的BP的发病机制中pDC的作用地位还未见报道。Zhu Xiaoxia等［3］报道尖锐湿疣患者皮损中CD2AP+pDC、CD123+pDC的密度和阳性率均比对照组边缘正常组织高。Van Seters等［5］报道HPV（+）的外阴上皮内瘤变（VIN）患者冷冻切片中pDC的数量增加。Bontkes HJ等［6］报道83%的HPV感染相关宫颈癌患者的冷冻切片中有pDC存在，pDC表达的HPV16病毒衣壳VLP受体—CD49f，与HPV16 VLP共培养分泌IFN-α，提示HPV16 VLP可通过诱导pDC分泌IFN-α来发挥抗病毒的免疫功能。本研究结果发现CD123+pDC在BP皮损组织中的密度较皮损旁正常组织中增高，细胞胞体较大。因此推测pDC可能参与了BP皮损中抗HPV感染的免疫反应，但BP易反复不愈的临床现状提示皮损中pDC虽然密度增加但可能未能建立有效的免疫应答。

TLR作为一种天然免疫模式识别受体，通过与相关病原分子结合，引发一系列细胞间信号转导、炎症介质的释放，在机体诱导与调节天然免疫以及获得性免疫过程中发挥重要作用。pDC高表达TLR7和TLR9［7］，TLR7主要识别病毒ssRNA，TLR9主要识别病毒CpG-ODN片段，可通过髓样分化因子88（MyD88）依赖或非依赖途径，活化核转录因子kappa B（NF-κB）或干扰素调节因子（IRF）家族（IRF-3、5、7），进而调节一系列炎症性细胞因子，最终影响pDC产生大量的 IFN-α，从而产生抗病毒反应［8］。Daud II等［9］研究显示在HPV16感染的宫颈上皮中，TLR7、TLR9的表达升高及相关细胞因子的诱导对于HPV16病毒的清除具有重要作用。Cannella F等［10］研究显示TLR9在HPV感染的宫颈黏膜中表达升高，在HPV的持续感染者TLR9的表达更高，HPV 16可以影响TLR9的转录，TLR9的升高如未能使HPV得以清除有可能提示患者向宫颈癌发展的可能性大。本研究结果显示，BP皮损真皮中TLR7和TLR9染色均较深，表达强度高于相应皮损旁正常真皮，与上述Daud II及Cannella F等研究报道的在HPV感染相关病变组织中TLR7、TLR9表达升高结果一致。推测HPV感染后局部皮损组织处于高水平免疫激活状态，尽管TLR7和TLR9在参与机体识别HPV或在抗病毒免疫应答、抑制HPV免疫逃逸中发挥重要作用，但可能未能扭转其他机制所致的局部免疫功能低下，而导致HPV感染呈持续状态。

Pearson相关性分析显示，BP皮损及皮损旁正常组织中，pDC细胞密度与真皮中TLR7表达强度之间、pDC细胞密度与真皮中TLR9表达强度之间均存在直线正相关，提示BP皮损真皮中TLR7和TLR9的表达升高可能与皮损局部pDC密度增高有关，由此推测BP皮损局部pDC未能发挥有效的细胞免疫功能可能不是因为pDC未能充分表达TLR7和TLR9的原因而造成，但具体原因尚需进一步研究阐明。