重组新城疫病毒对肺癌荷瘤鼠的治疗效果研究

李德山，张 旭，刘云野，田贵游，孙 田，安 莹，陈 睿

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

肺癌在恶性肿瘤中发病率和致死率较高，治疗途径一般为手术切除、放化疗等，费用昂贵且副作用大、易复发[1]。目前应用于临床治疗的病毒主要有腺病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、牛痘病毒、呼肠孤病毒和新城疫病毒等[2-3]，其中新城疫病毒为禽类病毒，其他病毒均可感染人类，具有潜在风险，如少数人感染呼肠孤病毒后造成呼吸道和胃肠道疾病[4]。Vigil等研究表明新城疫病毒在大多数肿瘤细胞内增殖能力是正常细胞一万倍以上[5]。Schirrmacher等将NDV-Ulster感染肿瘤细胞后制成肿瘤疫苗注射人体，结果表明新城疫不感染正常细胞，仅在肿瘤细胞中繁殖[6]。因此，新城疫病毒治疗肺癌靶向性和安全性良好。随着反向遗传操作技术不断成熟，可将RNA病毒反转录成cDNA，在cDNA上改造病毒基因组，组合成活力病毒[7]。Peeters等利用该技术成功拯救出两种新城疫病毒毒株[8]。Vigil等通过重组新城疫病毒分别表达外源因子IL2、TNF-α、GM-CSF和IFN-γ，结果表明重组新城疫病毒表达外源基因GM-CSF、TNF-α和IFN-γ组与空白对照组无显著差异，而重组新城疫病毒表达外源基因IL2与其他组相比，肿瘤体积明显减小，同时小鼠存活率显著改善[9]。为筛选一株先导病毒治疗肺癌，本文通过反向遗传操作技术重组新城疫病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2，比较体内和体外抑瘤试验，为重组新城疫病毒用于肺癌临床治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株和质粒

鸡胚成纤维细胞DF-1、幼仓鼠肾传代细胞株BHK-21和Lewis肺癌细胞购自ATCC。Clone30基因组pBrClone30-IL2、pBrClone30-P53、pBrClone30-P53-IL2，辅助质粒pTM-N，pTM-P，pTM-L均由东北农业大学生物制药教研室保存。

1.2 培养基及主要生化试剂

逆转录酶（M-MLV），RNaseA，RNA提取试剂Trizol均购自Promega公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶、rTaqDNA酶、dNTP、Oligo（dT）18购自NEB公司。

新生牛血清（NCS）、胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司。氨苄青霉素、硫酸链霉素购自Amersham Pharmacia Biotech公司。F12培养基、高糖DMEM培养基、1640培养基购自GIBCO公司。转染试剂Lipofectmine 2000购自Invitrogen公司。

1.3 试验动物

SPF鸡胚、鸡血购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。C57BL/6小鼠，6周龄，购自北京维通利华实验动物中心。

1.4 引物

鉴定重组病毒引物由TaKaRa公司合成。

Prime1：CCGCAGACCCAAGGTCCAACTCTCC

Prime2：GTCCTAGATGAGTCCATCTTGGCAC

1.5 细胞培养

1.5.1 细胞复苏

将保存于液氮罐中BHK-21细胞取出并迅速放置于37℃恒温水浴锅中，水浴过程不断震荡使之受热均匀，直至冻存管内液体融化。75%酒精棉擦拭冻存管表面，放置于无菌操作台，移液器将细胞移入15 mL无菌离心管中，加入5 mL提前预热的完全培养基混匀细胞，放置于离心机中，1 000 r·min-1离心5 min。离心后，再用75%酒精消毒，置于无菌操作台中。吸出上清液，加入少量细胞培养液混合均匀，以5～10倍稀释比例稀释细胞，随后将稀释后的细胞移入细胞培养瓶中，BHK-21细胞放置于5%CO2的CO2培养箱中，37℃饱和湿度条件下培养，培养基成分为10%新生牛血清，高糖DMEM培养基，青霉素100 U·mL-1，链霉素100 μg · mL-1。

1.5.2 细胞传代

显微镜观察细胞生长状况，当细胞间紧密接触时，作细胞传代。在无菌操作台中吸取培养瓶中培养液，用高温高压灭菌PBS盐溶液冲洗剩余培养液，加入0.25%胰蛋白酶溶液1 mL，置于37℃，CO2培养箱中胰蛋白酶消化3 min，显微镜下观察。当细胞间分离呈圆形时，将培养瓶置于无菌操作台，吸取胰蛋白酶溶液，加入新鲜培养液。吸管吸取培养液，将细胞吹打成细胞悬液。再次加入新鲜细胞培养，按照3～5倍比例稀释细胞，接种于新培养瓶，置于5%CO2培养箱，37℃饱和湿度条件下培养，至细胞生长对数期用于试验。

1.6 重组新城疫病毒拯救

按照Fastfilter Endo-Free Plasmid Maxi Kit说明书提取质粒pBrClone30-IL2、pBrClone30-P53、pBrClone-30-P53-IL2和3种辅助质粒pTM1-NP、pTM1-P、pTM1-L。

用G418隔代筛选BHK-21细胞，将培养至对数生长期细胞用含EDTA胰蛋白酶消化并收集，接种于六孔板内，待细胞生长至六孔板面积的70%～80%时，Lipofectmine 2000转染试剂，共转染BHK-21细胞。按照Invitrogen转染试剂盒说明书，首先用Opti-MEM（无血清培养基）洗涤2次，将提出质粒pTM-NP、pTM-P、pTM-L和 pBrClone30-IL2、pBrClone30-P53、pBrClone30-P53-IL2 分别取0.5、0.25、0.1 和 1 μg与 250 μL Opti-MEM 混匀，置于室温静置5 min，记作甲液。取10 μL Lipofectamin 2000与240 μL Opti-MEM混匀，置于室温静置5 min，记作乙液。甲乙混合，置于室温20 min。转染前，PBS清洗细胞单层1次，加入1mLOpi-MEM培养基。将转染液缓慢滴入细胞单层。转染6 h后弃去培养液，用含有10%DMSO的PBS液休克细胞2.5 min，加入完全DMEM培养液，继续培养72 h后，取出6孔板细胞冻存于-80℃冰箱，反复冻融3次，4℃低速（1 500 r·min-1）离心10 min，收集上清，取200 μL接种于8～9日龄SPF鸡胚中，72 h后，收获鸡胚中尿囊液，作常规血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验。收获阳性尿囊液并于-80℃冰箱冻存。拯救成功的病毒分别命名为rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2。

1.7 重组新城疫病毒鉴定与检测

1.7.1 拯救后重组新城疫病毒RT-PCR鉴定

将成功拯救获得的重组新城疫病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2，用TRIzol法提取重组新城疫病毒总RNA，反转录引物获得重组新城疫病毒cDNA样品。

在病毒P和M位点之间插入目的基因位点上游和下游设计引物，命名为Primer1和Premier2，将获得重组新城疫病毒反转录得到cDNA分别以Primer1和Premier2为引物扩增，然后连入pMD18-T载体并送公司测序。

1.7.2 新城疫病毒在DF-1细胞增殖能力检测

DF-1细胞复苏与传代方法同1.5.1与1.5.2。DF-1细胞生长条件为高糖DMEM培养基，10%胎牛血清，青霉素100 U ·mL-1，链霉素100 μg· mL-1，37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养。

将处于对数生长期鸡成纤维细胞DF-1接于96孔板，每个培养孔加入100 μL细胞悬液，使细胞量达到2～3×105个·mL-1。将重组新城疫病毒分别用基本培养基10倍倍比稀释，接入孔内与细胞孵育，每个稀释度接12个孔，每孔接种100 μL病毒悬液。感染细胞1h后，吸去液体并加入200 μL完全DMEM培养基，设不加病毒的正常细胞对照组，作两排对照（100 μL生长液+100 μL细胞悬液）。72 h观察并记录每一稀释度发生细胞病变孔数量，按Reed-Muench两氏法计算半数细胞培养物感染量（TCID50）。

Reed-Muench两氏法计算公式：

距离比例=（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）；

LgTCID50=距离比例×稀释度对数差+高于50%病变率稀释度对数。

1.7.3 新城疫病毒鸡胚稳定性检测

拯救后的重组新城疫病毒接种于SPF鸡胚尿囊液，连续传代10次。取1、3、5、7、9代病毒尿囊液测定病毒TCID50。

1.7.4 传代后重组新城疫病毒RT-PCR鉴定

将成功拯救获得rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2经SPF鸡胚传代10次后，用TRIzol法提取重组新城疫病毒总RNA，反转录引物获得重组新城疫病毒cDNA样品。将获得重组新城疫病毒反转录得到cDNA分别以Primer1和Premier2为引物扩增，连入pMD18-T载体并送公司测序。

1.8 MTT法测定重组新城疫病毒对LLC肺癌细胞抑制作用

LLC肺癌细胞（Lewis鼠源性肺癌细胞）复苏与传代方法同1.5.1与1.5.2。LLC细胞生长条件为高糖DMEM培养基，10%胎牛血清，青霉素100 U·mL-1，链霉素100 μg·mL-1，37 ℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养。

培养LLC（Lewis鼠源性肺癌细胞）肿瘤细胞至对数生长期，胰蛋白酶消化后收集，制备1×104个·mL-1细胞悬液，混合均匀后加入96孔板，每孔加200 μL癌细胞悬液，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养过夜，吸去培养基，PBS磷酸缓冲液洗涤1次，分为4组（rClone30-IL2、rClone30-P53、rClone30-P53-IL2和rClone30），每组实验孔分别加入0.1MOI、1MOI、10MOI重组新城疫病毒，对照孔加入等体积DMEM。48 h后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），孵育4 h后，移液器吸去培养液，每孔加入200 μL DMSO，轻微震荡10 min后，酶联免疫仪检测OD值，波长设定为490 nm。

癌细胞生长抑制率由下式计算：

抑制率%=（对照组OD均值-给药组OD值）/对照组OD均值×100%

1.9 LLC肺癌荷瘤小鼠模型建立

培养LLC肺癌细胞，显微镜观察细胞生长状况，发现细胞与细胞间紧密接触时，吸取培养瓶中培养液，PBS磷酸缓冲溶液冲洗培养瓶，向培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶溶液1 mL，置于37℃，CO2培养箱中消化约3 min，显微镜下观察。当细胞间分离呈圆形时，吸取胰蛋白酶溶液，加入新鲜培养液。吸管吸取培养液，反复吸打培养瓶壁上细胞成细胞悬液，计数后，培养液调整细胞密度为107个·mL-1备用。每只小鼠右侧腋下皮下注入剂量0.2 mL，约含2×106个肿瘤细胞，7～10 d后，挑选肿瘤直径5～6 mm小鼠用于分组治疗。

1.1 0 重组新城疫病毒对肺癌动物模型瘤体积抑制

将造模成功C57BL/6荷瘤小鼠除去形态、体重差异较大个体，剩余荷瘤小鼠按体重、瘤体积平均分配原则，每组8只。随机分为5组，分别为尿囊液对照组、rClone30组、rClone30-IL2组、rClone30-P53组和rClone30-P53-IL2组。试验组每2 d瘤内注射0.2 mL约107pfu的重组病毒，连续4次。尿囊液对照组每2 d瘤内注射与重组病毒等体积囊液，连续4次。

肿瘤体积计算公式如下：

1.1 1 生存率统计

经4次重组病毒治疗后，开展为期120 d存活观察，每隔5 d记录小鼠存活率情况，同时测量肿瘤体积，若肿瘤直径大于18mm，将小鼠安乐死。

2 结果与分析

2.1 重组新城疫病毒基因组结构

重组新城疫病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和pBrClone30-P53-IL2基因组结构如图1所示。

2.2 重组新城疫病毒拯救

pBrClone30-IL2、pBrClone30-P53、pBrClone30-P53-IL2重组质粒和辅助质粒pTM1-N、pTM1-P、pTM1-L共同转染BHK-21细胞。转染72 h后，收获转染细胞上清，在-80℃冰箱中反复冻融3次，然后接种于8～9日龄SPF级别鸡胚中，置于37℃孵化器内培养。72 h后，无菌条件下收获鸡胚尿囊液，通过血凝（HA）试验，血凝抑制（HI）试验检测后，取阳性结果尿囊液用鸡胚连续传代3次，经鸡血红细胞凝集检测。

结果显示rClone30-IL2血凝效价为211，血凝抑制效价为29；rClone30-P53血凝效价为29，血凝抑制效价为28；rClone30-P53-IL2血凝效价为210，血凝抑制效价为28。如图2所示。

2.3 拯救后的重组新城疫病毒RT-PCR鉴定

拯救感染性重组病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2经SPF鸡胚传代后，用TRIzol法提取重组新城疫病毒总RNA，反转录引物获得重组新城疫病毒cDNA样品，用病毒P和M位点基因上下游引物扩增目的基因，连入pMD18-T载体并送公司测序。测序结果经DNAMAN软件比对，证明拯救后重组新城疫病毒外源基因IL-2、P53、P53-IL2成功插入NDV基因组P和M基因之间，插入基因无突变。

2.4 重组新城疫病毒在DF-1细胞中增殖能力检测

图1 重组新城疫病毒的基因组结构Fig.1 Genome structure of recombinant Newcastle disease virus

图2 重组新城疫病毒血凝（HA）试验（A）和血凝抑制（HI）试验（B）Fig.2 Hemagglutination（HA）test（A）and Hemagglutination（HI）test（B）for recombinant Newcastle disease virus

将培养到对数期DF-1细胞，接入6孔板，待细胞生长至六孔板面积的70%～80%，将重组新城疫病毒经培养液稀释，每孔加入1 MOI重组新城疫病毒与细胞孵育，感染后分别在24、48、72和96 h，收获细胞上清。将DF-1细胞接96孔板，各时间点收集含有重组病毒上清，以10倍倍比稀释方式加入孔内与细胞孵育，每个稀释度接12个孔。72 h后显微镜观察DF-1细胞病变情况，按公式计算TCID50，试验设置3次重复，插入外源基因病毒在DF-1细胞增殖能力良好，未受影响。如图3所示。

2.5 重组新城疫病毒鸡胚增殖稳定性检测

为验证重组病毒增殖稳定性，将重组新城疫病毒在鸡胚尿囊腔接种连续传代。每次接种72 h后收获鸡胚尿囊液，测定HA效价，结果显示HA价分别介于28～211。将各代次鸡胚尿囊液分别作连续10倍倍比稀释，100 μL体积接种96孔板培养鸡胚成纤维细胞（DF-1），48 h后显微镜观察细胞病变情况，计算TCID50。

图3 重组新城疫病毒在DF-1细胞内增殖能力检测Fig.3 Detection of the proliferation of the recombinant Newcastle disease virus in DF-1 cells

rClone30-IL2的TCID50介于107.3至108.4，如表1所示。rClone30-P53的TCID50介于106.8至107.6，如表2所示。rClone30-P53-IL2的TCID50介于105.5至106.9，如表3所示。

表1 重组新城疫病毒rClone30-IL2在SPF鸡胚中稳定增殖能力检测Table 1 Identification of the proliferation of rClone30-IL2 ability in SPF embryo egg

表2 重组新城疫病毒rClone30-P53在SPF鸡胚中稳定增殖能力检测Table 2 Identification of the proliferation of rClone30-P53 ability in SPF embryo egg

表3 重组新城疫病毒rClone30-P53-IL2在SPF鸡胚中稳定增殖能力检测Table 3 Identification of the proliferation of rClone30-P53-IL2 ability in SPF embryo egg

2.6 传代后重组新城疫病毒RT-PCR鉴定

重组病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2经SPF鸡胚传10代后，用TRIzol法提取重组新城疫病毒总RNA，反转录引物获得重组新城疫病毒cDNA样品，用病毒P和M位点基因上下游引物扩增目的基因，连入pMD18-T载体并送公司测序。测序结果经DNAMAN软件比对，证明传代后的重组新城病毒外源基因IL-2、P53、P53-IL2存在于病毒基因组P和M基因之间，无基因突变。

2.7 MTT法测定重组新城疫病毒对LLC肺癌细胞抑制作用

将培养到对数生长期LLC细胞制备成1×104个·mL-1细胞悬液，接到96孔板培养过夜，每组试验孔分别加入0.1 MOI、1 MOI、10 MOI重组新城疫病毒感染，同时设置rClone30病毒作为对照组。感染48 h后加入MTT，孵育4 h后，移液器吸去培养液，每孔加入DMSO轻微震荡，酶联免疫仪检测OD值，波长设定为490 nm。计算重组新城疫病毒不同MOI感染条件下肿瘤细胞抑制率。

试验结果表明，重组新城疫病毒对肿瘤细胞抑制率成剂量依赖关系。在0.1 MOI、1 MOI和10 MOI下，rClone30-P53和rClone30-P53-IL2对LLC细胞的抑制作用与rClone30-IL2和rClone30相比差异极显著（P＜0.01）。如图4所示。

图4 重组新城疫病毒在不同MOI下对LLC肿瘤细胞抑制能力Fig.4 Cytotoxicity of recombinant Newcastle disease in LLC tumor cells infected with difference MOIs

2.8 重组新城疫病毒对LLC肺癌荷瘤小鼠抑制作用

当C57BL/6小鼠肿瘤达5～6 mm时，挑选肿瘤尺寸均一、形状规则荷瘤小鼠分为5组，每组8只。试验组每组小鼠注射1.0×107pfu·只-1rClone30、rClone30-IL2、rClone30-P53、rClone30-P53-IL2，对照组注射200 μL鸡胚尿囊液。每2 d注射1次，共4次，隔天观察1次，并同时测量肿瘤长径和短径，按照以下公式计算肿瘤体积。

比较尿囊液组、rClone30组、rClone30-P53组、rClone30-IL2组和rClone30-P53-IL2组肿瘤体积。结果显示rClone30对肿瘤抑制效果优于尿囊 液 对 照（P＜0.05）； rClone30-IL2、 rClone30-P53和rClone30-P53-IL2对肿瘤抑制效果显著优于尿囊液对照（P＜0.01）；rClone30-IL2和rClone30-P53对肿瘤抑制效果均优于rClone30（P＜0.05）；rClone30-P53-IL2对肿瘤抑制效果优于rClone30-IL2和rClone30-P53（P＜0.05），显著优于 rClone30（P＜0.01）。其中rClone30-P53-IL2对肿瘤抑制效果最佳。肿瘤体积测量结果如图5所示，实体肿瘤照片如图6所示。

图5 尿囊液、rClone30、rClone30-IL2、rClone30-IL12和rClone30-P53-IL2治疗肿瘤体积增长曲线Fig.5 Tumors growth cruve in allantoic Fluid,rClone30,rClone30-IL2,rClone30-IL12 and rClone30-P53-IL2 treated group

2.9 小鼠生存率曲线

图6 尿囊液、rClone30、rClone30-P53、rClone30-IL2和rClone30-P53-IL2治疗后肿瘤Fig.6 Tumor picture in allantoic fluid,rClone30,rClone30-P53,rClone30-IL2 and rClone30-P53-IL2 treated group

试验组小鼠接受为期120d观察，每隔2d测量一次肿瘤体积，当小鼠肿瘤直径＞18 mm时，将小鼠安乐死，计算各试验组小鼠存活率。经rClone30-P53-IL-2治疗小鼠存活率最高，为90%，与其他试验组比较，差异极显著（P＜0.01），试验结果见图7。

图7 重组病毒治疗后荷瘤鼠存活率试验Fig.7 Survival of the HCC tumor-bearing mice were sacrificed when the tumor volume developed to a significant size（diameter＞18 mm）

3 讨论与结论

近年肿瘤治疗新途径有基因疗法、免疫疗法、病毒疗法等。目前临床和临床前期研究的溶瘤病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、牛痘病毒、呼肠孤病毒均可感染人类，具有潜在返祖风险，若患者存在中和抗体，仅可治疗体表肿瘤。其中，新城疫病毒为禽类病毒，可侵染人体肿瘤细胞而对正常细胞无毒害作用。Bukreyev等研究表明，少数人感染新城疫病毒后，其轻微流感症状和结膜炎能够自愈[10]。Cantin等研究表明，多数肿瘤细胞膜表面存在大量唾液酸，新城疫病毒HN蛋白可识别肿瘤细胞表面唾液酸受体，介导病毒侵染肿瘤细胞[11]。因此，新城疫病毒用于肿瘤治疗靶向性和安全性良好，本研究以新城疫病毒用于肿瘤治疗。

通过反向遗传操作技术，改造新城疫病毒基因组，以病毒为载体表达抗肿瘤因子基因，增强病毒溶瘤效果。Vigil等研究表明，新城疫病毒上调肿瘤表面相关抗原，以新城疫病毒为载体表达IL2基因治疗荷瘤鼠与空白对照组相比差异显著[12]，与本研究结果一致。Fujiwara等研究表明，以腺病毒为载体表达P53基因治疗肺癌，可增加肿瘤细胞P53基因表达，有效抑制肿瘤中血管生成，防止肿瘤转移[13]。深圳赛百诺基因技术有限公司已通过重组腺病毒表达P53基因治疗肿瘤。腺病毒为人类病毒，具有潜在感染风险，本研究以禽类病毒为载体表达P53基因，在肿瘤治疗中安全性高。

重组新城疫病毒在DF-1细胞中增殖能力及鸡胚增殖稳定性检测结果表明，抗肿瘤因子基因插入未影响病毒感染天然宿主细胞能力，与Janke等研究结果一致[14]。RT-PCR结果表明，经鸡胚传至10代以内病毒基因均未发生突变，以新城疫病毒为载体表达抗肿瘤因子基因稳定性良好。体外抑瘤试验结果显示，rClone30-P53和rClone30-P53-IL2对LLC细胞抑制作用与rClone30-IL2和rClone30相比差异极显著（P＜0.01）。P53可上调bax表达，下调Bcl-2表达，改变线粒体外膜通透性，细胞色素C释放线粒体，细胞发生凋亡[15]。体外抑瘤试验结果显示，联合表达两种抗肿瘤因子rClone30-P53-I L2肿瘤抑制效果优于rClone30-IL2和rClone30-P53（P＜0.05），显著优于rClone30（P＜0.01）。体内与体外抑瘤试验差异可能是IL2作为免疫活性因子，依靠刺激、活化大量效应细胞如NK细胞、B细胞等，而非直接抑制肿瘤生长或杀伤肿瘤细胞[16]。癌症患者经放化疗后，免疫系统功能下降，联合表达两种抗肿瘤因子rClone30-P53-IL2治疗效果是否优于单一抗肿瘤因子rClone30-P53和rClone30-IL2，有待临床试验进一步探讨。

综上所述，与表达单基因重组病毒相比，表达双基因的重组病毒抗肿瘤效果显著，同时发挥免疫治疗和细胞凋亡效果。本研究为开发有效新城疫溶瘤病毒提供思路，为筛选高效先导病毒用于肺癌治疗奠定基础。