改性玉米蛋白作为脂肪替代物制备低脂沙拉酱

张英华，于鑫欣，赵多佳，张 钋，孙广梅，倪春蕾

（东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

玉米蛋白价格低廉、易获取，但乳化性较低，限制其食品生产领域应用[1]。改善玉米蛋白乳化性可提高其应用价值[2]。常用改性方法有物理、化学及酶法改性[3]。酶产业发展迅速，与化学改性相比，酶法改性以其安全、无毒、快速特点广受关注[4]。

传统沙拉酱为含油量较高（通常≥50%）半固体形态高脂肪乳状液[5]。近年来，脂肪替代物作为低脂食品生产中重要添加剂成为研究重点，常用脂肪替代物分为三大类：蛋白基脂肪替代物、脂肪基脂肪替代物和碳水化合物基脂肪替代物[6]。Yazicin等利用两种不同脂肪替代物替代酸乳中脂肪，得到与全脂酸奶产品相似酸奶[7]。Solowiej等以菊粉替代或部分替代脂肪，制备的干酪类似物中酪蛋白乳化特性和微观结构与传统干酪类似[8]。近年来应用碳水化合物作为脂肪替代物生产低脂食品研究颇多，但对蛋白基脂肪替代物研究较少。国外以蛋白质作为脂肪替代品研究中，主要应用蛋白质特有空间结构和乳化特性[9-10]。本文通过对预处理后玉米蛋白作酶改性，改善其乳化性，将改性玉米蛋白代替沙拉酱中部分油脂，使成品沙拉酱既保持原有口感和风味，又降低脂肪含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米蛋白粉购自山东福洋生物科技有限公司；碱性蛋白酶购自广东酶制剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

DK-98-ⅡA型恒温水浴锅购自常州赛普实验仪器厂；pHS-3C型精密PH计购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ-4000KDE型高功率数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；UV-240IPC紫外可见分光光度计购自日本岛津公司；FSH-2可调高速匀浆机购自金坛市宏华仪器厂；MAL高级流变仪购自英国马尔文公司；DS-1高速组织捣碎机购自上海精科实业有限公司；BME100L高剪切混合乳化机购自启东市长江机电有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米蛋白粉预处理

原料玉米蛋白粉去除油脂、脂肪酸、淀粉，采用超声波脱色处理[11]。将超声脱色处理后玉米蛋白溶液浓缩，冻干成粉。

1.2.2 蛋白质含量测定

采用凯式定氮法，参照GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白质测定》。

1.2.3 水解度测定

采用pH-stat法[12]。配置质量浓度为5 g·L-1玉米蛋白溶液于烧杯中，置于恒温磁力搅拌水浴锅中，加入碱性蛋白酶使其水解，用标定浓度为0.046207 mol·L-1NaOH溶液调至所需pH，完成滴定，使pH达到相对稳定状态。计时，到达水解时间时迅速取出，在沸水浴中加热5 min，终止反应。记录此时间段水解所需NaOH体积（mL），根据公式计算水解度（DH）：

式中，VNaOH-水解时消耗NaOH体积（mL）；CNaOH-NaOH浓度；Mp-蛋白质质量（g）；htot-每克蛋白中肽键当量数（9.2 mmol·L-1）；-氨基平均解离度（1.01）。

1.2.4 优化试验设计

1.2.4.1 单因素试验

选取水解时间（0～120 min）、酶与底物浓度比（263.45～1 580.68 U ·g-1）、酶解温度（30～55℃）3个因素，研究不同因素对玉米蛋白水解液乳化活性（m2·g-1）及乳化稳定性影响，确定各因素最佳水平[13-14]。

1.2.4.2 响应面法优化水解条件

以单因素试验结果为基础，应用响应面中心组合设计[15]，优化玉米蛋白水解工艺，利用Design-Expert 8.0.5软件统计分析数据。影响因素水平编码见表1。

1.2.5 乳化性测定

采用浊度法作测定[16]。

取10 mL色拉油与质量浓度为5 g·L-1待测液混合并不断搅拌，8 000 r·min-1下均质1 min。在0和10 min时分别从试管底部取出100 μL，立即用10 mL 0.1 mL·L-1SDS稀释，稀释液在500 nm处测吸光值，以SDS溶液作为空白。

式中， EAI为乳化活性（m2· g-1）；ESI为乳化稳定性；A0为乳化后0时刻乳化液吸光值；A10为静止10 min后乳化液吸光值；θ为油相所占体积分数（0.25）；C为玉米蛋白质质量浓度（5 g·L-1）。

1.2.6 沙拉酱产品制作

表1 试验因素水平及编码Table 1 Experimental factors and levels

沙拉酱基本原料组成，每100 g沙拉酱中含有色拉油40 g，蛋黄粉10 g，醋3 g，水40 g，白砂糖6.2 g，盐1.0 g，黄原胶0.8 g，变性淀粉2 g，高速均质机均质2 min，得到成品。以改性玉米蛋白替代油含量（%）与改性玉米蛋白浓度（g·L-1）为单因素，讨论其对沙拉酱成品流变学特性影响。

1.2.7 沙拉酱流变学分析

静态流变学分析：选择平行板夹具（型号P/40 mm），狭缝距离设置为500 μm。室温下剪切速率由 0-1升至 100 s-1并保持 480 s[17-18]。

动态流变学分析：频率范围为0～40 Hz，应变设置为0.5%，测定流变参数为弹性模量G′、粘性模量G″[19]。

1.2.8 数据分析

本试验数据均为3次试验平均值，采用Excel 2000和Design-Expert.V8.0.5等软件处理分析。

2 结果与分析

2.1 玉米蛋白预处理结果

预处理后蛋白质含量为：原料（0.6157±0.01）g·g-1，去脂肪（0.7177±0.03）g·g-1，去淀粉（0.8420±0.01）g·g-1，脱色处理（0.8843±0.01）g·g-1，每组试验平行3次。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 水解时间确定

由图1可知，水解产物乳化活性升后趋于平缓，乳化稳定性减后趋于平缓，40 min时水解产物乳化活性值达到最大，乳化稳定性值达到最小，原因是前40 min内随水解反应持续，肽键逐渐断裂，蛋白质分子柔性增加，油与水之间界面张力降低，乳化活性升高，乳化稳定性则降低。40 min后随酶解反应开始，一方面，蛋白质亲水基团大量暴露，亲水性增加而亲油性降低，乳化性略微下降；另一方面，底物逐渐耗尽，水解产物乳化活性及乳化稳定性趋于平缓。乳化活性与乳化稳定性大致呈相反趋势。选择酶解时间为10、40、70 min作后续响应面分析。

2.2.2 酶与底物浓度确定

酶与底物浓度比对水解产物乳化活性和乳化稳定性影响结果如图2，乳化活性随E/S增加而增加后趋于平稳，在1 317.23 U·g-1时达到最大值。乳化稳定性与其呈相反趋势，减后趋于平稳。酶与底物浓度比决定酶促反应速度，酶促反应快可加快玉米蛋白水解，提高玉米蛋白两亲性，乳化性逐渐增加，底物量决定最终水解产物乳化性趋于平稳。选择酶与底物浓度比为790.341、1 053.788、1 317.235 U·g-1作后续响应面分析。

2.2.3 酶解温度确定

由图3可知，随温度升高乳化性逐渐升高，在45℃达到最大值，后略降，原因是酶活性受温度影响，温度升高促进酶促反应，乳化活性逐渐增加，而温度过高则抑制酶活，45℃后乳化活性相对降低。乳化稳定性随温度升高而降低，50℃时达到最低，后略有回升。由于温度越高酶水解速度越快，肽链数量快速增加不利于乳液稳定，温度达到一定程度时，酶活降低使酶促反应速度下降，此时蛋白水解速度平缓且结构被打开，因此乳化稳定性提高。选择酶解温度为35、40、45℃作后续响应面分析。

2.3 响应面试验结果

图1 酶解时间对玉米蛋白乳化活性和乳化稳定性影响Fig.1 Effect of enzymolysis time on emulsifying activity and emulsion stability

图2 酶与底物浓度比对玉米蛋白乳化活性和乳化稳定性影响Fig.2 Effect of ratio of enzyme and substrate concentration on emulsifying activity and emulsion stability

图3 酶解温度对玉米蛋白乳化性和乳化稳定性影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on emulsifying activity and emulsion stability

根据单因素试验结果，优选酶解时间、酶与底物浓度比、酶解温度3个因素，确定最佳试验方案，以乳化活性和乳化稳定性为响应值设计3因素3水平响应面分析试验，共17个试验点，其中包括12个分析因子，5个为零点，经过零点试验估计误差，结果见表3。表3试验结果经过Design-Expert 8.0.5软件中ANOVA程序分析，去除不显著因素，得到各试验因子对响应值影响回归方程模型为：

式中，EAI为乳化活性（m2· g-1）；ESI为乳化稳定性；X1为反应时间（min）；X2酶与底物浓度比（U ·g-1）；X3为反应温度（℃）。

由表4中可见，乳化活性EAI和乳化稳定性ESI回归方程模型极显著（P＜0.01），2个模型失拟项不显著（分别为0.2262，0.3573均大于0.05），说明该回归方程拟合度较好，可真实反映反应酶解时间、酶与底物浓度比E/S、反应温度与乳化活性和乳化稳定性关系。

从方差分析可见，乳化活性EAI一次项X1、X2、X3影响均达到极显著水平（P＜0.01）；交互作用项X1X2、X1X3对改性玉米蛋白EAI影响显著（P＜0.05），交互作用项X2X3影响不显著，二次项中X12、X22对改性玉米蛋白EAI有极显著（P＜0.01）影响，X32表现为不显著。说明X1、X2与乳化活性存在线性关系和二次函数关系，各单因素间存在交互。乳化稳定性ESI中一次项X1、X2和二次项X12影响达到极显著水平，X3、X1X2与二次项X22对改性玉米蛋白乳化稳定性影响显著（P＜0.05）而交互作用项X2X3、X1X3、X32影响不显著，说明各参数对改性玉米蛋白乳化稳定性不仅为线性关系，X1、X2间存在交互作用，其他因素之间交互作用不明显，各因素之间存在二次函数关系。

表3 玉米蛋白水解Box-Behnken试验条件及结果Table 3 Design program and experimental results of Box-Behnken experiment

表4 Box-Behnken试验方差分析Table 4 Variance and significant analysis of Box-Behnken design test

综上所述，以Design-Expert 8.0.5软件对回归方程分析求解，EAI和ESI均取最大值，得到最佳方案为酶解时间33.19 min、酶与底物浓度比894.5 U·g-1、温度为41.01℃，此时乳化活性7.423 m2·g-1、乳化稳定性为67.17。

2.4 沙拉酱流变学分析

自制玉米蛋白沙拉酱见图4。

2.4.1 静态流变学分析

由图5中剪切应力与粘度随剪切速率变化曲线可知，替代油含量从10%逐渐增加后，沙拉酱体系粘度降低，剪切应力体现食品屈服应力，空白样品与10%替代油含量样品剪切应力曲线相似，说明二者涂抹性相似。因此改性玉米蛋白可替代沙拉酱中油脂。

图4 自制玉米蛋白沙拉酱Fig.4 Salad made from modified corn protein

图5 不同改性玉米蛋白替代油含量沙拉酱静态流变曲线Fig.5 Static rheological curves of different modified corn protein replacement oil contents

由由图6可知，在替代油含量为10%基础上，改性玉米蛋白浓度从10 g·L-1逐渐增至70 g·L-1，50 g·L-1时低脂沙拉酱粘度曲线及剪切应力曲线均与空白样品最为接近，此时可较好模拟全脂沙拉酱粘度及涂抹性。

2.4.2 动态流变学分析

由图7弹性模量与粘性模量随频率变化曲线可知，在改性玉米蛋白替代油含量为10%和20%时，低脂沙拉酱粘性及弹性更接近传统沙拉酱，替代量逐渐增加，曲线偏离空白试样曲线，沙拉酱粘性及弹性均降低。综合静态流变学分析，当替代油含量为10%时，低脂沙拉酱可较好模拟全脂沙拉酱。

由图8弹性模量与粘性模量随着频率变化流变学曲线可知，当替代油含量为10%，改性玉米蛋白浓度为30 g·L-1时，低脂沙拉酱弹性模量曲线最接近空白样品曲线；当改性玉米蛋白浓度为50 g·L-1时，低脂沙拉酱粘性模量曲线与空白样品曲线相似，其次为30 g·L-1。综合静态流变学分析，当改性玉米蛋白浓度为50 g·L-1时，低脂沙拉酱具有与全脂沙拉酱相似流变学特性。

图6 不同浓度改性玉米蛋白沙拉酱静态流变学曲线Fig.6 Static rheological curves of modified corn protein with different concentrations

图7 不同改性玉米蛋白替代油含量沙拉酱动态流变学曲线Fig.7 Dynamic rheological curve of different modified corn protein substitute oil content

图8 不同浓度改性玉米蛋白沙拉酱动态流变学曲线Fig.8 Dynamic rheological curves of modified corn protein with different concentrations

3 讨论与结论

通常使用改性淀粉、菊粉、果胶、微晶纤维素、乳化剂等作为脂肪替代物制备酱体食品，但蛋白质乳化指数较低，影响酱体食品稳定性[20]。尚小磊等研究表明，酱体食品流变学特性对产品质地及稳定性尤为重要[21]。Shen等发现，蛋黄用量为10.6%，葡萄糖当量（DE）为8.1的燕麦糊精作为脂肪替代物，脂肪替代率为27.9%时，低脂蛋黄酱产品比全脂蛋黄酱粘度高而卡路里值低[22]。王嫣等以20%油脂含量无蛋沙拉酱配方为基础，添加5.5%变性淀粉制备低脂沙拉酱，其增稠稳定性和感官指标较好[23]。Bortnowska等采用预糊化马铃薯淀粉作为脂肪替代物制备低脂沙拉酱，添加量为5%时低脂沙拉酱具有与传统沙拉酱相同质构性质与纹理结构[24]。

沙拉酱是典型酱体食品，本试验采用玉米蛋白作为脂肪替代物制备低脂沙拉酱。由于玉米蛋白乳化性较低，需改善其乳化性，根据玉米蛋白氨基酸组成和与碱性蛋白酶水解位点，选择碱性蛋白酶水解玉米蛋白，得到乳化活性7.348 m2·g-1、乳化稳定性为67.26的玉米蛋白水解液。传统沙拉酱中含有40%的油脂，用改性玉米蛋白替代10%的油脂时，流变学特性模拟结果与传统沙拉酱相似。玉米蛋白水解液的浓度影响低脂沙拉酱质地，在油脂替代量为10%基础上，浓度为50 g·L-1时模拟状态良好，与传统沙拉酱吻合。

在单因素试验基础上，对酶解时间、酶与底物浓度比、酶解温度作响应面分析。得到最佳酶解时间为33.16 min、酶与底物浓度比为895.15 U·g-1，酶解温度为40.50℃，玉米蛋白乳化活性为7.422 m2·g-1，乳化稳定性为67.19。