TLR-9 基因多态性与膝骨关节炎的易感性研究

黄飞飞 毛应德龙

作者单位：浙江中医药大学附属第二医院检验科（黄飞飞）、骨科（毛应德龙）（杭州310005）

骨关节炎（OA）是一种常见的迟发性退行性关节病，目前关于OA 的病因学或骨重建与软骨退化的相对重要性知之甚少。近年研究显示，除年龄、性别、体质指数（BMI）、种族和创伤等因素外外，还有许多遗传因素被确定与OA 的发病有关[1-2]。Toll 样受体（TLRs）是一类模式识别分子，在先天免疫系统中发挥独特的功能[3]。TLR-9 位于染色体3p21.2 上，通过其配体刺激TLR-9 触发所有TLR 共有的信号传导途径，导致核因子-κB（NF-κB）转录因子的激活和促炎细胞因子的产生[4]。本研究通过检测TLR9 基因rs187084 和rs5743836 位点单核苷酸多态性，探讨其基因多态性与膝骨关节炎（KOA）易感性的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2013 年4 月—2017 年5 月期间浙江中医药大学附属第二医院收治的145 例KOA 患者作为研究组，同时期招募145 名健康受试者作为对照组，膝骨关节炎的严重程度采用Kellgren-Lawrence 分级[5]评价，研究组排除标准：（1）其它类型的关节炎；（2）既往有膝关节外伤手术史；（3）患有代谢性骨病；（4）类风湿性关节炎患者；（5）患有糖尿病、高血压的患者。对照组排除标准：（1）既往有膝关节外伤手术史；（2）患有免疫系统疾病的患者；（3）患有代谢性骨病的患者。本研究获得我医院学伦理委员会审核通过，所有受试者均签署知情同意书。

表1 研究组和对照组一般资料比较

图1 TLR9 基因rs187084 位点和rs5743836 位点测序结果。A-C 分别为rs187084 位点TT、TC、CC 基因型测序结果。D-F 分别为rs5743836 位点CC、CT、TT 基因型测序结果

1.2 方 法 取所有受试者静脉血2mL，采用EDTA-K2 抗凝后采用硅胶模技术纯化受试者基因组DNA，试剂盒为QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit（品牌：Qiagen，型号61104），保存于-20℃冰箱。根据NCBI 数据库中TLR9 基因rs187084 和rs5743836 位点序列信息设计PCR 扩增引物，rs187084 位点引物序 列 为 上 游：5’-ACTGGATCCTGGGGATGCAGA-3’，下游：5’-AGCTGACATTCCAGCAGGGGA-3’。rs5743836 位点引物序列为上游：5’-CGGAAGATG TTGCAAGGCTGT-3’，下游：5’-GGGCCAGGGTGTA GCTTGAG-3’。引物由上海生工生物工程技术公司合成。

1.3 基因分型 根据设计的引物，以提取的基因组DNA 作为模板进行PCR 扩增，反应体系为20μL，其中基因组DNA 50ng，10×PCR 缓冲液2μL，1.5μL 25mmol/L 的Mg2+，1μL 10μmol/L dNTP，10pmol/L 的上下游引物各1μL，DNA 聚合酶1U，无菌水补足至20μL。PCR 翻译条件为：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30 个循环后72℃延伸5min。PCR 完成后将PCR 扩增产物送上海生工生工生物工程技术公司进行测序，分析受试者TLR9 基因rs187084 和rs5743836 位点基因型，结果见图1。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0 软件，计量资料以均值±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。计数资料以[例（%）]表示，组间比较采用χ2检验。用χ2检验分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。使用χ2检验或Fisher 精确检验分析等位基因和基因型频率的差异，估计比值比（OR）和95%置信区间（CI）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究组与对照组基线资料比较 两组受试者的年龄、体质指数（BMI）、性别、Kellgren-Lawrence 分级等一般资料见表1，研究组患者年龄、BMI 均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），性别差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 TLR9 基因SNP 与膝骨关节炎风险的相关性TLR9 基因rs187084 位点和rs5743836 位点基因型频率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。rs187084位点基因型频率在研究组和对照组间差异有统计学意义（χ2=10.42，P=0.01），CC 基因型是膝骨关节炎（KOA）的保护因素（OR=0.321，95%CI=0.147-0.690，P=0.001），C 等位基因是膝骨关节炎（KOA）发生的保护因素（OR=0.599，95%CI=0.424-0.847，P=0.002）。rs5743836 位点基因型频率在研究组和对照组之间的差异无统计学意义（χ2=5.14，P=0.08），T 等位基因不是膝骨关节炎（KOA）发生的危险因素（OR=0.680，95%CI=0.417-1.108，P=0.102），见表2。

2.3 TLR9 基因SNP 与性别之间的相关性 比较不同性别之间TLR9 基因rs187084 位点和rs5743836位点基因型频率之间的差异结果显示，TLR9 基因rs187084 位点和rs5743836 位点基因型频率在男性和女性之间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表2 研究组和对照组TLR9 基因SNP 与KOA 风险的相关性位点基因型和等位基因频率[例（%）]

表3 TLR9 基因SNP 与性别之间的相关性[例（%）]

2.4 TLR9 基因SNP 与年龄之间的相关性 以55岁为界限，比较不同年龄下TLR9 基因rs187084 位点和rs5743836 位点基因型频率之间的差异，结果显示，不同年龄受试者的TLR9 基因rs187084 位点基因型频率之间差异有统计学意义（P＜0.001），TT 基因型频率在55 岁以上年龄段受试者中较高，而CC 基因型频率在55 岁以下受试者中较高。rs5743836 位点基因型频率在不同年龄受试者之间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

2.5 TLR9 基因SNP 与KOA 严重程度的相关性分析TLR9 基因rs187084 位点和rs5743836 位点基因型频率与Kellgren-Lawrence 分级之间的相关性，结果显示，TLR9 基因rs187084 位点基因型频率与Kellgren-Lawrence 分级相关，CC 基因型频率在3 级和4 级KOA 患者中较低（OR=0.14，95%CI=0.040-0.473，P＜0.001），TC 基因型与Kellgren-Lawrence 分级无相关性（P＞0.05）。rs5743836 位点各基因型频率与Kellgren-Lawrence 分级无相关性（P＞0.05），见表5。

表4 TLR9 基因SNP 与年龄之间的相关性[例（%）]

表5 TLR9 基因SNP 与Kellgren-Lawrence 分级相关性[例（%）]

3 讨 论

TLR 有两个非常重要的功能，首先，TLRs 通过识别微探针相关的分子模式与先天性和适应性抗感染宿主防御的激活有关；其次，TLR 在自身炎症和炎性因子产生中起重要作用[6]。TLR9 可以识别非甲基化的富含CpG 和病原体来源的DNA 序列[7]，并通过刺激B 细胞增加自身免疫性疾病的风险[8]。

TLR9 基因的rs187084 多态性位于启动子区域，Haploview 筛选发现它是一个标记SNP。因此，TLR9基因rs187084 多态性与相关疾病之间的关联已被广泛研究，如系统性红斑狼疮（SLE）[9]、骨关节炎[10]、疟疾[11]和脓毒症[12]。研究表明，在SLE 患者中发现TLR9过表达[13]，这可能刺激B 细胞并诱导SLE 发病。近年研究显示，TLR9 可能在OA 的病因学中发挥着重要的功能，TLR9 通过够激活NF-κB 转录因子来影响促炎细胞因子的产生，从而促进OA 的发展[14]。另外，有研究证实，TLR9 基因SNP 影响基因表达和功能[15]。

TLRs 是与先天和获得性免疫反应有关的基本分子[16]。许多研究关注TLR9 启动子多态性（rs187084）与自身免疫性疾病（如SLE）之间的关联[9]，类风湿性关节炎[17]和OA[18]。此外，有研究显示，TLR9 基因rs5743836 位点单核苷酸多态性与非霍奇金淋巴瘤（NHL）发生相关，rs5743836 位点突变的患者的单核细胞中TLR9 的转录活性增加[19]。本研究的目的是分析TLR9 基因的rs187084 位点和rs5743836 位点单核苷酸多态性与KOA 易感性的关系，结果显示，研究组患者中携带rs187084 位点突变型等位基因C的频率显著低于对照组，说明rs187084 位点C 等位基因是KOA 的保护因素，与Balbaloglu 等[18]研究结果一致。另外，Suet 等[20]研究了中国台湾人群TLR9基因rs187084 位点多态性与膝骨关节炎的风险之间的相关性，结果显示，rs187084 多态性的T 等位基因与OA 的风险增加有关，同样与本研究结果一致。本研究并未发现rs5743836 位点多态性与KOA 易感性之间的相关性，而在Carvalho 等[21]研究中发现TLR9基因rs5743836 多态性与TLR9 介导的疾病发生相关，携带TC 基因型rs5743836 的单核细胞中，IL-6上调TLR9 表达，导致对CpG 的细胞响应加剧，包括IL-6 产生和B 细胞增殖。本研究并未观察到这种相关性，笔者分析认为可能与样本量过小有关。

年龄和性别等因素也与KOA 的发生相关[22]，本研究同时还分析了TLR-9 基因的rs187084 位点和rs5743836 位点单核苷酸多态性与年龄、性别相关性，结果显示，TLR9 基因rs187084 位点和rs5743836位点基因型频率在男性和女性之间差异无统计学意义（P>0.05），说明这两个位点与性别无相关性，而在不同年龄受试者中rs187084 位点基因型频率有显著差异，具体表现为在高年龄受试者中TT 基因型频率较高，结合老年患者KOA 风险高我们可以发现，TT基因型受试者是KOA 危险因素。此外，本研究还发现，TLR9 基因rs187084 位点基因型频率与Kellgren-Lawrence 分级相关，CC 基因型频率在Kellgren-Lawrence 分级3 级和4 级中较低，说明KOA 越严重，CC 基因型频率越低，由此可见C 等位基因是KOA 的保护因素。

本研究有以下不足之处。首先，吸烟、饮酒等生活习惯因素可能会对结果产生影响。其次，样本量相对较小，统计分析的功效较差。第三，在这项基于医院的病例对照研究中，选择偏倚是不可避免的。最后，由于有限的临床信息，未进一步的亚组分析。

综上所述，TLR9 基因rs187084 1486 T>C 位点单核苷酸多态性与KOA 易感性相关，rs5743836 1237 C>T 位点单核苷酸多态性与KOA 易感性不相关。还需要进一步扩大样本量进行验证。