红枣白兰地致浊成因与澄清方法研究

李树萍，焦 娇，李美萍，张生万

(山西大学生命科学学院，山西太原030006)

红枣白兰地是以红枣为原料，通过生物酶解、发酵、蒸馏和陈酿等工序制得的蒸馏酒[1]，深受消费者青睐。目前，有关红枣白兰地的研究主要集中在成分分析[1-10]，甲醇的检测及其含量的控制[11-16]及色泽稳定性[17]，但对影响产品外观及其品质浑浊的研究尚未见报道。关于蒸馏酒浑浊的研究主要集中在白酒和白兰地，白酒浑浊的成因主要是加浆降度时[18-21]，酒中物质的溶解度发生变化；彭德华[22]首次提到提高白兰地的稳定性，但尚未提到白兰地浑浊成因。在红枣白兰地生产过程中，勾兑是必不可少的步骤。故探明其致浊成因及建立有效的除浊方法显得尤为重要。

以42%vol红枣白兰地为基酒，对改变酒精度时的变化行为进行了研究。发现酒液在降度和增加酒精度时均不同程度地出现失光、浑浊现象。采用红外光谱法和化学分析法对低度（20%vol）和高度（72%vol）红枣白兰地致浊物进行分析可知：低度红枣白兰地的致浊物主要是多酚与蛋白质缔合物，并有少量高级脂肪酸酯类化合物；而高度红枣白兰地的致浊物主要是糖类及水溶性酚类物质。通过单因素试验和响应面法对红枣白兰地的澄清剂进行筛选，结果表明，20%vol红枣白兰地最佳澄清剂为壳聚糖-明胶复合澄清剂，其添加量为壳聚糖0.066 g/L，明胶0.64 g/L，最大透过率为99.825%，72%vol红枣白兰地以硅藻土为澄清剂效果较好，其用量为0.12 g/L时，透过率为99.972%。该结果将为后期红枣白兰地生产、储藏和品质的控制提供一定的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红枣白兰地（42%vol），山西万里红酒业有限公司提供；无水乙醇，市售分析纯。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；Nicolet 380傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo公司；UV-2550双光束紫外光谱仪，日本岛津公司；SGZ-B系列便携式浊度计，上海悦丰仪器仪表有限公司；SCIENTZ-18N真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；比色管，天津玻璃仪器有限公司；1 cm密封石英比色皿，德国莱斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

向红枣白兰地基酒（42%vol）中加入适量的蒸馏水或无水乙醇，分别配制成20%vol、32%vol、50%vol、63%vol和72%vol的红枣白兰地。

明胶溶液：取一定量的明胶用10倍的水加热溶解，配成体积分数10%的明胶溶液备用[23]。

壳聚糖溶液：将1 g壳聚糖置于100 mL体积分数为2%的醋酸溶液中加热搅拌至完全溶解，配成体积分数为1%的壳聚糖溶液备用[23]。

2%硅藻土悬浮液：称取2 g硅藻土，用98 mL蒸馏水浸泡24 h，充分吸水膨胀后，搅拌均匀，备用[24]。

皂土悬浮液：称取10 g皂土，加入100 mL蒸馏水在60℃水浴中膨胀，浸泡24 h，使用前搅拌成均匀的浆体[25]。

水不溶玉米面的前处理：玉米面经50～60倍质量的水浸洗至少3～4次后过滤、烘干后研细[26]，过40目筛备用。

1.3.2 不同酒液浊度的测定

按1.3.1节方法得到的不同酒精度红枣白兰地，用浊度仪测定其浊度。

1.3.3 致浊物类型分析方法

将20%vol和72%vol红枣白兰地放入-5℃冰箱冷藏7 d，去除上清液，浑浊液移至10 mL离心管中。以4000 r/min的速率离心20 min，再用等量（3 mL）相应浓度的乙醇溶液洗涤沉淀3次，对沉淀物进行真空冷冻干燥，再用干燥过的KBr进行压片，测定其红外吸收光谱。同时采用文献[27]的方法进行分析验证。

1.3.4 除浊条件选择

1.3.4.1 澄清剂的选择

按1.3.1节方法制得的澄清剂，取100 mL20%vol和72%vol红枣白兰地各5份，分别加入4 g水不溶玉米面，0.4 mL壳聚糖、明胶、硅藻土、皂土溶液，静置24 h，测定离心管上清液在400 nm和700 nm波长处的吸光度值。

1.3.4.2 单因素试验

向100 mL 20%vol和72%vol红枣白兰地中加入不同浓度的壳聚糖、明胶和水不溶玉米面和硅藻土。

1.3.4.3 响应面法优化20%vol红枣白兰地复合澄清剂配比

通过单一澄清剂的澄清效果试验，选择壳聚糖、明胶进行复配，作为复合澄清剂。利用Design-Expert 8.0软件中的Central-Composite模型，以透过率（T%）作为响应值（Y），以壳聚糖（A）和明胶（B）的体积分数为主要考察因子，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，因子编码及水平见表1。

表1 壳聚糖-明胶复合澄清剂试验因素水平及编码值

1.3.4.4 澄清指标的测定

吸光度的测定：在UV-2550双光束紫外光谱仪上，以相应浓度的乙醇溶液做参比，测定酒样在400 nm和700 nm波长处的吸光度值。风味成分相对百分含量的测定：采用GC-MS分析法，通过面积归一化法分析风味成分相对百分含量的变化（不含乙醇）。

1.3.5 除浊方法

取一定量的20%vol和72%vol红枣白兰地，分别向20%vol的红枣白兰地中加入不同浓度比的壳聚糖和明胶溶液，72%vol的红枣白兰地中加入不同浓度的硅藻土悬浮液。静置24 h，然后取出置于离心机内离心（4000 r/min、20 min），取离心管上清液，在波长700 nm处测其透过率，透过率越高，澄清效果越好。

2 结果与分析

2.1 不同酒精度溶液浊度的测定

按1.3.1节方法得到的不同酒精度红枣白兰地，采用1.3.2方法对不同酒精度溶液的浊度进行测定。其结果见图1。

由图1可知，随着酒精度的增加，酒液浑浊度先下降后上升，只有当酒精度为40%vol～52%vol时，浊度较小，酒液澄清。而酒精度低于40%vol和高于52%vol时均有失光、浑浊现象，这一现象表明：低度酒和高度酒的致浊物可能分别为水不溶性和酯不溶性化合物。故应选择较低酒精度（20%vol）的红枣白兰地和较高酒精度（72%vol）的红枣白兰地分别获取沉淀物进行致浊物类型的分析。

图1 不同酒精度红枣白兰地的浊度变化趋势

图2 a 20%vol红枣白兰地沉淀红外光谱图

图2 b 72%vol红枣白兰地沉淀红外光谱图

2.2 致浊物类型分析

按1.3.3.节方法，分别获取低度酒和高度酒沉淀物后，进行红外光谱测定和化学分析验证。

2.2.1 致浊物红外光谱分析

低度（20%vol）酒和高度（72%vol）酒沉淀物的红外光谱按1.3.3节方法测定。其结果见图2a和图2b。

由图2a可知：3417.82 cm-1νOH、3076.8 cm-1ν=C-H、1633.69 cm-1νC=C、1273.00 cm-1ν=C-O，表明20%vol酒的致浊物中可能含有酚类化合物；2939.48 cm-1νasC-H、2864.26 cm-1νsC-H和1423.45 cm-1δCH吸收峰以及在波数高于1633.69 cm-1处吸收峰与其重叠致使1633.69 cm-1不对称峰形表明，致浊物中可能含有蛋白质类和高级脂肪酸酯类化合物。结果表明，低度酒的致浊物可能是蛋白质与酚类化合物缔合[28]，并混有少量高级脂肪酸酯类化合物。

由图2b可知：3410.11 cm-1νOH、2929.84 cm-1νC-H、1429.23 cm-1δC-H、1732.05 cm-1νC=O、1068.55 cm-1νC-O和1010.68 cm-1νC-O的吸收，表明72%vol红枣白兰地致浊物中可能含有糖类化合物。3410.11 cm-1νOH、1642 cm-1νC=C、1271.07 cm-1ν=C-O，表明 72%vol酒的致浊物中可能含有水溶性的酚类化合物。结果表明，高度酒的致浊物可能是糖类及水溶性酚类化合物。

2.2.2 致浊物中多酚类物质的分析

采用文献[27]三氯化铁-铁氰化钾试剂法对20%vol和72%vol红枣白兰地的致浊物进行定性分析，实验结果，均呈现明显的蓝色斑点。表明致浊物中含有酚类物质，所得结果与红外吸收光谱相吻合。

2.2.3 致浊物中蛋白质类物质的分析

采用文献[27]茚三酮法对20%vol和72%vol红枣白兰地的致浊物进行定性分析，实验结果，20%vol呈现紫色，72%vol未显色。表明20%vol红枣白兰地致浊物中含有蛋白质，72%vol红枣白兰地致浊物中不含有蛋白质，得到的结果与红外吸收光谱相吻合。

2.2.4 致浊物中糖类物质的分析

采用文献[27]Molish法对20%vol和72%vol红枣白兰地的致浊物进行定性分析，实验结果，20%vol未出现紫红色环，72%vol出现紫红色环。表明20%vol红枣白兰地致浊物中不含有糖类，72%vol红枣白兰地致浊物中可能含有糖类，与红外光谱图结果相吻合。

2.3 致浊成因

由图1可知，当红枣白兰地酒精度为20%vol～40%vol和大于52%vol时，浑浊度较大，酒液出现失光、浑浊现象。这一现象揭示了红枣白兰地的致浊物与其溶液极性有关。结合红外光谱法和化学分析法对低度（20%vol）酒和高度（72%vol）酒的致浊物分析结果可知，在低度酒中为一些醇溶蛋白与多酚类化合物相互作用形成的缔合物及高级脂肪酸酯类化合物等所致[29]；而在高度酒中主要是水溶性多酚及多糖等醇溶性差[30]的物质所致。

2.4 澄清剂效果分析

2.4.1 最佳除浊剂的筛选

取20%vol和72%vol红枣白兰地各5份，每份100 mL，向其中加入不同澄清剂，搅拌均匀后，静置24 h，测定不同澄清剂的澄清效果。根据红枣白兰地紫外吸收光谱图（图3），以400 nm波长处的吸光度考察褪色情况，以700 nm波长处吸光度考察除浊情况，其结果见表2。

图3 红枣白兰地紫外吸收光谱图

表2 不同澄清剂对红枣白兰地在400 nm和700 nm波长处吸光度测定结果

由表2可知，经不同澄清剂处理后的红枣白兰地与原酒相比，在400 nm和700 nm波长处的吸光度值均有所减小，表明色度有所降低，透明程度升高。对上述5种澄清剂试验结果进行比较可知，20%vol红枣白兰地宜选用壳聚糖、明胶和水不溶玉米面作为澄清剂；72%vol红枣白兰地宜选用硅藻土和水不溶玉米面作为澄清剂。

2.4.2 20%vol红枣白兰地单一澄清剂效果

2.4.2.1 壳聚糖溶液的澄清效果（图4）

由图4可知，随着壳聚糖用量的增加，20%vol红枣白兰地的透过率先增加后趋于稳定，当壳聚糖用量为0.6 mL/100 mL时，透过率为99.541%，此时澄清效果达到最佳。

图4 壳聚糖用量对20%vol红枣白兰地澄清效果的影响

2.4.2.2 明胶溶液的澄清效果（图5）

图5 明胶用量对20%vol红枣白兰地澄清效果的影响

由图5可知，随着明胶用量增加，20%vol红枣白兰地的透过率先增加后趋于稳定。当明胶用量为0.8 mL/100mL时，透过率达到最大，为97.949%，此时澄清效果最佳。

2.4.2.3 水不溶玉米面的澄清效果（图6）

由图6可知，随着水不溶玉米面用量的增加，20%vol红枣白兰地的透过率先呈上升趋势后趋于稳定。当玉米面用量为8 g/100 mL时，透过率为94.977%，此时澄清效果最佳。

比较3种澄清剂对20%vol红枣白兰地的透过率可知，壳聚糖和明胶的澄清效果优于水不溶玉米面，故对二者进行复合，使其澄清效果达到最佳。

2.4.3 72%vol红枣白兰地单一澄清剂效果

图6 水不溶玉米面用量对20%vol红枣白兰地澄清效果的影响

2.4.3.1 硅藻土溶液的澄清效果（图7、图8）

图7 硅藻土用量对72%vol红枣白兰地澄清效果的影响

图8 硅藻土用量对72%vol红枣白兰地最大吸收波长的影响

由图7可知，随着硅藻土用量的增加，72%vol红枣白兰地的透过率先上升后趋于稳定，当硅藻土用量为0.6 mL/100 mL时，透过率为99.972%，此时澄清效果最佳。由于硅藻土澄清剂中含有微量的金属离子，可能会与酒中的物质发生反应。由图8可知，最大吸收波长未发生移动，硅藻土未引起72%vol红枣白兰地色泽的改变。

2.4.3.2 水不溶玉米面的澄清效果（图9）

图9 水不溶玉米面用量对72%vol红枣白兰地澄清效果的影响

由图9可知，随着水不溶玉米面用量的增加，72%vol红枣白兰地的透过率先增加后趋于稳定，当水不溶玉米面用量为6 g/100 mL时，透过率为99.583%，此时澄清效果最佳。使用水不溶玉米面为澄清剂，可以较为有效的除浊，是一种无毒无害的天然食品澄清剂。

综上分析可知，硅藻土对72%vol红枣白兰地的澄清效果略优于水不溶玉米面，故选硅藻土作为72%vol红枣白兰地的最佳澄清剂。

2.4.4 20%vol红枣白兰地复合澄清剂的澄清效果

2.4.4.1 Central-Composite试验设计与方差分析

对壳聚糖-明胶澄清方法进行响应面分析，以透过率（Y）作为评价指标，响应面设计方案与结果见表3，方差分析见表4。

表3 响应面设计方案和试验结果

利用Design-Expert8.0Trial数据处理软件中ANOVA程序对表3的试验结果进行二次回归分析，计算出方程各项系数并进行方差分析，可得2个因子与Y之间的回归方程：Y=99.21+2.22A-1.45B+0.95AB-1.22A2-1.12B2。

表4 试验结果方差分析

由表4可知，本实验所选用的模型显著（P＜0.0001），失拟项P=0.505＞0.05，不显著；模型的校正系数RAdj2=0.9911，相关系数R2=0.9678，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用此来分析和预测壳聚糖-明胶复合澄清剂的澄清作用。由表4回归方程系数显著性检验可知，壳聚糖对20%vol红枣白兰地透过率的影响极显著（P＜0.01），明胶对20%vol红枣白兰地透过率的影响极显著（P＜0.01）；二次项AB、A2和B2也对透过率影响极显著（P＜0.01）。这表明各试验因素对透过率的影响呈二次关系，且因素之间存在交互作用。

2.4.4.2 响应面分析

壳聚糖（A）和明胶（B）两因素对透过率响应面和等高线见图10。由图10可知，壳聚糖和明胶的用量以及壳聚糖和明胶间的交互作用对透过率的影响极其显著（P＜0.01）。

利用Design-Expert8.0数据处理软件中ANOVA程序对回归模型分析得到最优结果为壳聚糖0.66 mL/100 mL，明胶0.64 mL/100 mL，在此条件下，预测透过率为100.32%，优于单一澄清剂。为了验证模型的合适性和有效性，进行验证试验。在壳聚糖0.66 mL/100 mL、明胶0.64 mL/100 mL时，20%vol红枣白兰地的透过率为99.825%，与模型的预测值透过率（100.32%）相符，说明回归方程可应用于实践中。

2.4.5 澄清剂对红枣白兰地风味成分的影响

图10 壳聚糖和明胶用量的交互作用对透过率影响的响应面和等高线

表5 澄清剂对红枣白兰地风味成分的影响

测定经过最佳澄清剂处理前后的红枣白兰地的酯类、酸类、醇类、醛类及酮类含量和种类的变化，结果见表5。

由表5可知，经澄清剂处理的红枣白兰地其风味成分的种类数未发生变化，含量变化较小，故对红枣白兰地整体风味影响小。

3 结论

采用红外光谱法和化学分析方法对低度（20%vol）和高度（72%vol）红枣白兰地的致浊物进行了分析。结果表明：低度（20%vol）酒致浊物可能是蛋白质与酚类化合物缔合物，并有少量高级脂肪酸酯类化合物；高度（72%vol）酒致浊物可能是糖类及水溶性酚类化合物。为此，添加不同澄清剂对低度（20%vol）酒和高度（72%vol）酒进行了单因素试验和响应面法分析，结果表明：低度（20%vol）酒的最佳澄清剂为壳聚糖-明胶复合澄清剂，其添加量为壳聚糖0.066 g/L、明胶0.64 g/L，最大透过率可达99.825%；高度（72%vol）酒以硅藻土为澄清剂，其用量为0.12 g/L时，透过率为99.972%。经最佳澄清剂处理后的红枣白兰地，其风味成分的种类数未发生变化，含量变化较小，不影响酒的整体风味。该结果为后期红枣白兰地生产、储藏和品质的控制提供了一定的理论和实验依据。