Ⅰ型变态反应过敏原体外诊断现状

张立营 赵权

变态反应也称为过敏反应，这意味着免疫系统对某些对身体无害的物质(如花粉，动物皮肤等)过于敏感，并且会发生免疫反应，对身体造成伤害。人们每天遇到的皮肤过敏，皮肤瘙痒，发红和肿胀都是过敏反应。Ⅰtypeallergy又称速发型变态反应，在临床上最常见。全世界有30%～40%的人被过敏问题困扰，过敏已成为全球第六大疾病[1-2]。日常生活中常见的过敏反应主要是以IgE抗体(specific IgE antibodies，sIgE)介导、组胺等介质释放为基础的Ⅰ型变态反应而产生。通过检测患者血清过敏原的特异性IgE抗体，可明确患者的过敏原，对于疾病的预防、诊断及治疗均具重要意义。本文按照反应原理阐述了目前过敏原特异性IgE抗体的体外检测常见技术，并对其研究进展进行了分析。

1 酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)

1971年，瑞典学者Engvail和Perlmann报道了ELISA，ELISA是一种免疫标记技术，其中已知的抗原或抗体吸附在固相载体的表面上，以使酶标记的抗原-抗体在固体表面上反应[3]。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体，具有快速、灵敏、简便、易于标准化载体的优点。检测IgE抗体时，普通酶免法是将过敏原包被在固相载体上，然后加入患者血清，此时患者血清中除了特异性IgE抗体外，特异性IgG抗体也会和过敏原结合，造成载体上部分位点的抢占。而捕获法是将抗人IgE抗体包被在固相载体上，加入患者血清后，血清中的IgE抗体都被结合，而IgG抗体不会被结合下来而被洗脱，随后加入待检过敏原，再加入酶和底物显色。由于该法去除了血清中IgG抗体的干扰，从而明显提高了IgE抗体检测的灵敏度。使用捕获法可以完全捕获出血清中的IgE抗体，去除IgG抗体干扰，显著提高检测IgE水平的敏感度，并且可以实现过敏原自由灵活组合、定量检测[4-5]。

2 放射过敏原吸附试验(radio allergosorbent test，RAST)方法

RAST将纯化的过敏原与固相载体相结合，添加待测血清和参照对照，然后与同位素标记的抗IgE抗体反应，然后测定固相的放射活性，通过标准曲线测定待测血清中特异性IgE的含量，或者当样品的放射性高于正常人数加3S时判断为阳性。这种试验方法的发展首次使得对过敏原特异性IgE进行可靠的识别，至此，过敏原特异性IgE水平的体外测定及过敏症临床病史开始成为过敏症研究及临床诊断方面的根基。RAST的原理是在固体载体上使过敏原与相关特异人群血清的IgE结合，通过竞争性结合IgE，利用同位素或酶标记抗体，配合荧光底物检测结合IgE的抗体[6-7]。RAST方法虽然简便、快速、灵敏，但由于应用到放射性标记物质，存在一定的放射性污染风险。

3 免疫印迹法(Western blot，WB)

WB是一种将高分辨率凝胶电泳与免疫化学分析技术相结合的杂交技术。基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理的细胞素膜)，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分[8-10]。

4 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)

CLIA将高灵敏度化学发光测量技术与高度特异性免疫反应相结合，用于检测和分析各种抗原，半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物。它是放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析后开发的一种新的免疫分析方法。从临床实践看，当血液样本中的IgE浓度很低时，传统检测技术由于受到检测灵敏度、特异度和检测范围等因素的限制可能出现检测结果阴阳性不符的情况。纳米磁微粒化学发光免疫诊断技术综合采用了目前国际上的两大主流免疫分析尖端技术——悬浮磁微粒载体技术和化学发光检测技术，该系统具有检测范围宽、灵敏度高、特异度强、快速准确等优点和特性，从方法学角度来看其优于荧光酶免法[11-14]。其优势在于过敏原可以随机、自由组合，敏感度高、特异度强，全定量。

5 微流控芯片技术(microfluidics)

微流控芯片技术将生物、化学和医学分析过程中的样品制备、反应、分离和检测等基本操作单元集成到微米级芯片上，自动完成整个分析过程[15-18]。目前有该技术用于过敏原IgE抗体检测，此微流体免疫技术系统将自动化微流体技术、蛋白质微数组技术、冷光分析技术与平行化IgE分析技术相结合。将过敏原固定于微流卡反应区，可同时平行处理数十种过敏原特异性IgE抗体，藉由微流体的导入，血清用量仅需100微升；随后通过加入试剂进行相应反应并置于化学发光分析仪上进行判读结果，全程约35 min完成[19-20]。此技术优势在于灵敏度高、快速、样本量需求少，但目前还缺少大通量自动化仪器。

6 总结

研发过敏原体外诊断检测技术是过敏性疾病预防、诊断和治疗的核心之一。近年来，过敏性疾病基于IgE抗体检测而诊断变态反应性疾病的研究发展迅速，形成了诸多检测手段。在分级诊疗的大背景下，不同级别医院对于过敏原特异性IgE抗体体外检测的性能需求不同。基层医院以满足过敏患者首诊需求、降低费用为主，会以定性/半定量筛查或灵活组合为主，三级医院为保证检验结果的精准性，会更需要全定量检测产品。目前在国内全定量检测产品仍较少，且成本高昂，不利于全面开展变态反应临床工作。随着检验技术的发展以及过敏性疾病诊治研究进展的深入，过敏原检测的定性或半定量技术将逐渐向定量转变。过敏原体外诊断检测技术有着光明的发展前景。