急性胰腺炎内质网应激反应机制研究进展

程璐 韩树堂

南京中医药大学附属医院，南京 210029

【提要】 胰腺腺泡细胞具有丰富内质网，适应其合成消化酶的生理功能。各种损伤因素引起蛋白质折叠需求与内质网折叠能力失衡，大量未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔内蓄积，引起内质网应激。内质网应激的过度激活可能是触发和加重急性胰腺炎胰腺损伤的重要应激机制，涉及未折叠蛋白反应的信号转导、炎症反应的加重、腺泡细胞的凋亡、胰腺酶原颗粒自噬等多个方面。

内质网是真核细胞内功能活跃的重要细胞器，其生理功能主要是合成膜蛋白和分泌蛋白，启动翻译后修饰，保证蛋白质折叠成正确的空间构像，同时也参与脂质和类固醇代谢。当各种病因(如缺氧、Ca2+超载、氧化应激等)打破内质网平衡时，内质网折叠和修饰功能受损，大量未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔内蓄积，引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS是一种涉及体内稳态和内质网功能紊乱之间的失衡状态。新近的研究表明急性胰腺炎(AP)的发生、发展在细胞生物学水平与ERS密切相关，ERS的过度激活可能是触发和加重胰腺损伤的重要应激机制[1-3]。本文根据近期相关研究进展，探讨ERS在AP进程中的作用。

一、内质网应激与未折叠蛋白反应

胰腺腺泡细胞具有丰富内质网，以适应其合成消化酶的生理功能。各种新合成的消化酶被运送至内质网，与伴侣分子免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)，也称葡萄糖调节蛋白78(78-kD glucose-regulated protein，GRP78)结合。BiP/GRP78是一种主要定位于内质网的钙离子结合分子伴侣，借助其水解ATP的耗能过程促进蛋白质正确折叠、进行翻译后修饰。各种损伤因素作用均可引起内质网蛋白质加工、运输障碍或摄取、释放Ca2+障碍，从而引起蛋白质折叠需求与内质网折叠能力失衡，导致蛋白质不能正确折叠、糖基化形成障碍或蛋白质不能形成正常的二硫键，内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白堆积，引起ERS。当内质网中未折叠或错误折叠的蛋白增多时，应激信号通过内质网膜传递到细胞核，继而引起一系列特定的靶基因转录和蛋白质翻译水平下调，使细胞继续存活，这种反应称为未折叠蛋白反应[4](unfolded protein response，UPR)。

胰腺细胞发生ERS初期，UPR被激活，用以恢复内质网稳态，保护细胞生存[5]。UPR通过以下3种内质网跨膜蛋白进行调节：(1)蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase r-like ER kinase，PERK)；(2)肌醇需要酶1α(Inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)；(3)活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。UPR的关键因素是热休克蛋白家族成员BiP/GRP78。在非ERS情况下， BiP/GRP78与3种跨膜蛋白结合，维持信号转导因子在未激活状态[6]。当内质网腔内大量未折叠蛋白蓄积时，BiP/GRP78即与3种跨膜蛋白解离，转而与未折叠蛋白结合，使解离后的3种信号转导蛋白处于活化状态，进而启动UPR信号通路。

1．PERK途径：PERK在胰腺中广泛高表达，与GRP78/BIP解离后，PERK可通过胞质内结构域的自身二聚化和磷酸化而激活，促使下游的真核生物转录起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，进而使翻译起始mRNA迅速减少，减缓或暂停蛋白质的合成，降低内质网对新合成蛋白折叠需求的压力[7]。实验研究表明[8]，PERK缺失的小鼠可在4周大小时出现β细胞为主的胰腺功能不全，6～8周时以腺泡细胞为主。反之，eIF2α磷酸化的缺失增加了β细胞合成大量蛋白质并促进蛋白质折叠的需求，这同样增加了胰岛素原的折叠和错误折叠，错误折叠蛋白在内质网内堆积，加重了氧化应激[9]。这些现象提示ERS反应中PERK介导的eIF2α磷酸化阻止mRNA翻译、减少折叠蛋白的负荷而防止错误折叠蛋白的聚集，从而使细胞得以存活。

2．ATF6途径：内质网腔内未折叠蛋白增多，使ATF6与BiP分离，ATF6转移到高尔基体，被高尔基体S1P(site-1 protease)和S2P(site-2 protease)蛋白酶水解，释放出N端转录激活结构域，产生活化型ATF6入核，结合于启动子ERS反应元件(ER stress response element，ERSE)，诱导X盒结合蛋白1(X-box-binding protein1，XBP1)转录表达，促进蛋白质在内质网腔内的正确折叠[10-11]。

3．IRE1途径： ERS时，活化的IRE1α切割其底物XBP1前体mRNA，剪接后的mRNA发生翻译框移，编码产生有活性的转录因子sXBP1。sXBP1诱导的目标基因可以增强内质网蛋白折叠能力，加速错误折叠蛋白的降解[12-13]。

UPR的信号转导高度复杂，ERS可以激活PERK/eIF2α、IRE1/XBP1和ATF6介导的通路阻断翻译的进程，减少内质网的蛋白合成负担，增加伴侣分子以及蛋白折叠相关分子的数量。此外，ERS能激活其相关的分子，如内质网相关蛋白降解(ER-assisted protein degradation，ERAD)基因，可以识别，通过泛素-蛋白酶体通路从内质网内腔清除错误折叠的蛋白，并与非内质网相关细胞通路相互作用，最后导致ERS的解除[14]。当内质网紊乱超过细胞的调节能力时，内质网稳态无法得到恢复，ERS逐渐加重，将引起细胞损伤或凋亡。

二、内质网应激与急性胰腺炎

1．ERS参与AP的早期阶段：AP的发病机制尚未完全被阐明，病理性腺泡内胰蛋白酶原活化被认为是胰腺炎发生和发展的关键。胰腺腺泡细胞的内质网含量丰富，胰蛋白酶原合成于内质网。在蛙皮素诱导的AP模型中，早期的ERS与胰蛋白酶原的活化有关[15]。

在内质网功能紊乱情况下，胰腺细胞更容易受外界刺激影响，内质网的结构在胰腺炎时发生显著改变。Bhatia等[16]报道，逆行注射牛磺胆酸钠到胰管几分钟内，腺泡细胞损伤以内质网囊泡粒子的形成为特征，这一现象与ERS相关受体PERK、IRE1、ATF6及其下游通路的激活有关。随后，多种类型的胰腺炎动物模型研究中，包括注射牛磺胆酸钠、L-精氨酸、高脂饮食、胰胆管结扎等造模方式，早期均观察到内质网形态学的改变，主要表现为内质网局部或广泛扩张、空泡形成以及核糖体的减少，表明在AP的早期阶段即存在ERS[17-20]。

2．ERS与胰腺腺泡损伤：ERS与过度UPR参与胰腺腺泡细胞的损伤及炎症反应，促进AP发展。 Kubisch等[21]观察到L -精氨酸诱导的AP大鼠在造模早期就出现了明显的ERS，其标志为PERK的磷酸化及其下游靶点eIF2α、ATF6移位进入细胞核，以及BiP的上调。其随后研究[17]也发现，UPR在AP发病中亦起到重要作用，包括分子伴侣BiP表达、PERK磷酸化、XBP1拼接以及CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达，且不同的促分泌素激活胰腺腺泡细胞中的ERS也不同，只有超生理水平的CCK8与抑制淀粉酶的分泌、胰蛋白酶活化刺激PERK磷酸化以及CHOP表达相关。此外，还观察到AP病程中内质网伴侣蛋白及UPR关键调节分子表达水平的改变，包括BiP、CHOP、PERK、eIF2、ATF6、Xbp1等，以期提高ERS细胞处理未折叠蛋白或抵御其他细胞应激的能力。在蛙皮素和牛磺胆酸钠诱导的胰腺炎模型中[22]，早期即出现了UPR关键调节分子的表达上调，胰腺细胞中IRE1和BiP的激活发生在牛磺胆酸钠给药后3 h[23]。在精氨酸诱导的重症急性胰腺炎(SAP)模型中，发现PERK、ATF6和IRE1及其下游信号均被激活[24]，亦提示ERS与胰腺炎腺泡细胞损伤密切相关。

3．ERS与AP炎症反应加重：ERS在多种疾病中通过核因子-kappaB(NF-κB)通路引起炎症反应，UPR通过PERK、IRE1和ATF6 3条信号通路激发炎症反应，进而激活NF-κB信号通路[25-26]。AP时，ERS通过NF-κB被激活，其中钙离子和蛋白激酶C的病理学改变是涉及NF-κB激活的主要因素[27]。ERS引起NF-κB活化和胰腺腺泡细胞的坏死，炎症反应和腺泡细胞坏死的持续积累导致胰腺炎持续进展加重[28-29]。使用NF-κB小分子抑制剂可以阻断ERS，抑制胰腺炎的进展[30]。此外，NF-κB 下游的炎性因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)亦会导致UPR的活化，表现为XBP1和GRP78的表达增加以及eIF2α的磷酸化[31]。同理，TNF-α、IL-1β和IL-6可引起细胞的ERS，导致cAMP反应元件结合蛋白H的活化[32]。这种机制可能与炎症递质干扰蛋白的正常折叠和线粒体的代谢平衡，进而使钙离子释放的增加和内质网氧化应激聚集有关，启动炎症反应。

4．ERS与胰腺腺泡细胞凋亡：当ERS过于强烈或持续存在时，UPR不足以恢复内质网稳态，引起细胞功能失调并触发细胞凋亡途径，以清除有功能缺陷的应激反应细胞，维持整个生物体的稳定。ERS通过调节细胞死亡加重胰腺腺泡细胞的炎性损伤，从而加速了胰腺炎的病理过程[33]。

ERS启动胰腺细胞凋亡的机制主要包括以下几种：(1)C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)途径；(2)凋亡信号调节激酶(apoptosis signal-regulating kinase, ASK)1/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase, JNK)途径；(3)半胱天冬酶-12(caspase-12)途径；(4)Ca2+通路途径。其中CHOP途径是ERS特异性转录因子[34-35]。UPR的3条信号转导通路均可引发CHOP的表达， PERK-eIF2α-ATF4是激活CHOP的主要途径。高表达的CHOP能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，引起Bax蛋白从细胞质向线粒体移位，破坏Bax/Bcl-2比例，触发线粒体凋亡途径[36]。相反，CHOP基因缺陷小鼠Bcl/Bax比值增高，细胞凋亡明显减轻[37]；激活的CHOP可以使磷酸化的eIF2α去磷酸化，引起蛋白质合成增加，加重ERS。此外，CHOP还可以通过激活GADD34、激活氧化应激和胞质内钙超载诱导细胞凋亡[38]。

5．ERS与胰腺酶原颗粒自噬：含有酶原颗粒的自噬空泡(自噬体或自噬溶酶体)在腺泡细胞内大量堆积是AP发病早期的标志性特征，与AP发生和发展紧密关联。生理性自噬是指胰腺腺泡细胞的酶原颗粒选择性自噬，是胰腺的一种内源性保护性机制，通过VMP1-USP9x-P62通路介导的泛素自噬途径实现[39]。但AP时自噬空泡的数量和体积均显著增大，彼此间互相融合，表明此时的自噬为一种功能障碍的缺陷性自噬，是AP反应过度、异常激活自噬或自噬紊乱的结果。缺陷性自噬无法满足腺泡细胞对损伤细胞器清除的要求，从而进一步加重胰腺的病理损伤。

ERS是细胞自噬的诱发因素，其介导的细胞自噬主要依赖于UPR和Ca2+信号，连接ERS与自噬的UPR信号通路包括PERK-eIF2α、IRE1-TRAF2-JNK，可通过促进自噬体分隔膜的延伸、自噬囊泡的聚集，上调自噬过程，平衡ERS诱导的内质网膨胀。Ca2+的持续升高主要通过钙调节蛋白依赖性激酶-β(calmodulin-dependent kinase kinase-β, CaMKK-β)介导的AMPK活化，并最终通过激活TSC1/2复合物来抑制mTORC1的活性，从而促进自噬[40-41]。

胰腺炎的发病机制与自噬小体的积累有关，乙醇诱导的胰腺炎通过激活ERS，作用于UPR的PERK/eIF2α分支，细胞自噬与ERS相互反应，并与蛋白质降解或内质网破坏相关[42-43]。IRE1-XBP1通过调节基因表达对ERS起负反馈调节，以达到维持蛋白折叠和清除错误折叠蛋白的作用。IRE1α与TRAF2相互反应，激活JNK表达，引起ERS诱导的自噬，且XBP1已被证实是通过Beclin-1转录激活调节自噬，PERK则通过ATF4触发自噬[44]，可见ERS通过多种机制与自噬密切相关。

AP的发生和发展进程中，胰腺腺泡细胞损伤是一个由多种因素介导的复杂的生物学过程，由于对其机制的认识尚不完全充分和深入，针对该疾病预防和治疗的有效策略仍然不足。ERS早期阶段，一定程度上UPR可以激活细胞的保护性适应，但持续严重存在的ERS，内质网稳态无法恢复，则造成细胞功能恶化，甚至导致细胞损伤和凋亡。深入研究参与胰腺腺泡细胞损伤进展的启动和恶化因素，尤其是胰腺炎中ERS和UPR的根本的完整的机制是迫切需要的。尝试从致病机制途径寻找保护胰腺的有效方法，可能为AP的临床治疗开辟新的治疗方法，具有重要的临床指导价值和现实意义。

利益冲突所有作者声明不存在利益冲突