长链非编码RNA在多发性骨髓瘤发生发展中的作用*

贺玉钦 高文 综述 陈文明 审校

随着对多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的认识不断加深，新型检测技术，如原位荧光杂交（fluorescencein situhybridization，FISH）、高通量测序（highthroughput sequencing）、基因芯片（gene microarray）和定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的迅速发展，对MM的细胞遗传学异常有了更为深入的了解。MM 危险分层（Mayo stratification of myeloma and risk- adapted therapy，mSMART）分为低危、中危、高危3个等级，对应不同的预后及治疗策略［1］。不同的等级对应的基因异常的类型和严重程度均不同。随着研究的不断深入，发现长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的数目变化与MM的基因异质性密切相关，通过遗传学检测技术已发现部分关键的lncRNA并揭示其功能［2］。本文旨在对MM细胞遗传学异常领域的部分问题进行综述。

1 lncRNA的概念

在对基因组转录的过程中发现，部分转录组并不能作为蛋白翻译的模板，称为非编码RNA（non-coding RNA，ncRNAs），根据核苷酸的长度，分为短链和长链，其中长链非编码RNA（lncRNA）指核苷酸数超过200个，占转录组长度的一半之多，进化程度高且保守。哺乳动物基因组序列中4%～9%序列产生的转录本为lncRNA，国际上收录lncRNA的LNCipedia数据库包含120 353个已标记的人类lncRNA［3］。lncRNA有很大的基因异质性，参与细胞生理和基因组活动的多个过程，部分lncRNA被归因为与肿瘤的形成、进展、凋亡、分化、转移和侵袭等过程有关，部分有致肿瘤作用，部分有抑制肿瘤的作用，甚至与放化疗的敏感性有关。但是，多数lncRNA相关的疾病事件机制并未明确，除了参与肿瘤发生和进展，lncRNA还可作为肿瘤诊断和预后评价的生物标记物，甚至可以用于药物分子作用靶点［4］。

2 lncRNA与肿瘤

有研究发现，lncRNA与肿瘤的发生、发展存在相关性主要表现在lncRNA具有组织特异性表达及调节的特点，对细胞周期、细胞生存和免疫应答等具有独特的影响，导致正常细胞分化成不同表型的肿瘤细胞［5］。1）部分lncRNA通过肿瘤抑制物或癌基因进行转录调节，85%非编码区的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）与疾病相关［6］，如神经母细胞瘤相关的SNP 位于lncRNA 神经母细胞瘤相关转录物1（neuroblastoma associated transcript 1，NBAT1），与NBAT1差异性表达有关。NBAT1通过沉默神经元特异性转录因子REST抑制细胞分化和侵袭［7］。2）通过分析lncRNA与不同组织细胞生物学过程的关联性，发现lncRNA与癌症发生的主要通路相关，通过作用在一些控制癌症发生的关键部位达到致癌作用。如控制肿瘤抑制因子（p53）、分化和生存因子（NF-κB）、哺乳动物的雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR）、转录因子E2F、雄激素或雌激素受体等均提示lncRNA和蛋白编码基因类似，为转录调节因子，控制着关键的肿瘤抑制因子和原癌基因通路。3）lncRNA在转录后的调节方面也发挥作用，如mRNA的剪切、翻转、输出和翻译，甚至对翻译后蛋白质的稳定性和修饰也有影响［8］。总之，lncRNA在肿瘤中的作用包括作为肿瘤的抑制因子和原癌基因、顺式/反式作用元件和参与转录后调节。

3 lncRNA与MM

诸多研究提示lncRNA与MM关系密切，在浆细胞发生癌变事件的各个时期，如出现IgH易位、发生超二倍体和NRAS/BRAF基因激活等事件的过程中，不同的lncRNA会发生情况各异的表达，部分进行上调表达，部分进行下调表达，并参与到基因变化的复杂生物学机制中。当癌变的浆细胞到达最终浆细胞白血病时，多数关键的lncRNA均发生变化。因此，lncRNA的作用机制与MM的恶性度关系密切［9］。不同的lncRNA生物学来源和作用机制差异较大，本文针对有定论的lncRNA特点，对比和总结这些lncRNA的不同生物学行为。

3.1 转移相关性肺腺癌转录物1

转移相关性肺腺癌转录物1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）为一种假肿瘤源性lncRNA，由染色体11q13转录，在部分实体肿瘤中过度表达［10］。有研究表明，MALAT1上调与细胞周期相关分子通路、p53 介导的DNA 损伤修复、mRNA 成熟过程相关，复发或进展的MM 患者MALAT1 表达增高［9］。MALAT1 的表达趋势与DNA结合蛋白高运动组盒1（high mobility group box 1，HMGB1）一致，HMGB1 维持骨髓瘤细胞生存和增殖的关键物质，为细胞自噬的介导因子［11］。在一项体外实验的小鼠MM 细胞系中，敲除MALAT1 减少HMGB1 的表达水平并伴随自噬基因Beclin-1 和LC3B 的下降，显著降低MM 细胞的活性，增加其凋亡［12］。MALAT1 沉默导致细胞周期素D1（cyclin D1）和细胞周期素E（cyclin E）表达下调，激活半胱天冬酶-3（caspase-3）和半胱天冬酶-9（caspase-9），增加促凋亡蛋白BAX，降低抗凋亡蛋白BCL-2 表达［13］。上述研究结果提示，MALAT1 促进MM 的自噬，上调HMGB1 的表达，促进凋亡的抑制和延长肿瘤细胞生存。有研究发现，MALAT1可能与MM的髓外浸润有关，尤其是发生在多次化疗后，提示与耐药性相关，降低总生存率（overall survival，OS）和无进展生存率（progression-free survival，PFS），通常提示不良预后［14］。此外，MALAT1 在间充质细胞中过表达，导致转录性激活临近反义蛋白编码基因3（latent-transforming growth factor beta-binding protein 3，LTBP3）的表达，该基因可正性调节肿瘤坏死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）的活性，并抑制终末期成骨细胞生成［15］。可见MALAT1 在MM 发生发展中发挥重要作用，与MM疾病复发和进展相关。

3.2 结直肠肿瘤差异性表达物

结直肠肿瘤差异性表达物（colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE）是一个定位于16q12.2的lncRNA，在直肠癌中表达上调。研究发现，该lncRNA在早期人类发育、部分实体肿瘤及白血病和MM中均表达升高［16］。Meng等［17］采用qRT-PCR研究发现，在MM细胞系和患者中的CRNDE表达增加，与不良的OS及肿瘤侵袭进展相关。在CRNDE敲除的细胞系（U266和RPMI-8826）中引起凋亡增加和细胞周期停止在G0/G1期，通过小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染细胞系并敲除CRNDE，miR-451的表达大幅增加。通过生物信息学和双荧光素酶实验证实，miR-451和CRNDE的3′-UTR为假性互补作用，MM的CRNDE和miR-451呈负相关，可能为CRNDE通过竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的分子海绵作用负性靶向调节miR-451实现。提示对miR-451的抑制可以补偿CRNDE敲除后的效应，抑制肿瘤的发生。

3.3 母系表达基因3

母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）为位于14q32.2的lncRNA，是一种通过p53依赖或非依赖的肿瘤调节物，控制肿瘤的表观遗传学表达，功能实验证实转染并表达MEG3和其同等亚型，显著上调p53的蛋白水平，增加p53增强子的转录［18］。通过研究MM患者中MEG3的表达，Benetatos等［19］发现60%患者差异甲基化区域（differentially methylated region，DMR）的高度甲基化与疾病的分期及亚型有关。2/3的IgG型MM和所有IgM型MM表现出表观遗传学改变，但是无一例IgA型的MM有高度甲基化DMR。提示MEG3 lncRNA增强子可能与DMR高度甲基化有关，表达降低与MM肿瘤发生有关。在骨的分化过程中，MM患者的间充质细胞（MM-MSC）较正常供者的（ND-MSC）MEG3表达程度略低。过表达MEG3可以促进MM-MSC分化，而敲除MEG3对ND-MSC的骨生成有减弱作用。MEG3通过转录一种TGF家族的基因-骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）来促进骨生成。MEG3和BMP4均定位于14号染色体，MEG3直接作用于转录因子SRY 基因相关高运动组盒2（SRY related high mobility group box 2，SOX2），促进其与BMP4增强子分离并决定BMP4的表达增加［20］。

3.4 尿道上皮癌相关因子1

尿道上皮癌相关因子1（urothelial cancer associated 1，UCA1）为位于19p13.12 的lncRNA，通过基因表达分析和基因芯片筛选的方法首先在膀胱移行上皮癌中发现，诊断膀胱癌的特异性91.8%（78/85）和敏感性80.9%（76/94）均较高［21］。Zhang 等［22］采用qRTPCR 检测MM 患者骨髓样本的UCA1 和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），提出UCA1 可能是与MM 预后相关的lncRNA，下调UCA1显著抑制细胞系的增殖，促进细胞的凋亡，正性调节TGF-β，过表达TGF-β 部分抵消UCA1 的敲除作用。在83 例MM 骨髓样本中，27 例lncRNA 差异性表达，UCA1 在MM 的患者中显著低于健康对照，与白蛋白水平呈正相关，与血清单克隆免疫球蛋白水平呈负相关。高水平的UCA1 与不良的OS 和发生del（13q14）、1q21+或t（4；14）易位相关［23］。在膀胱癌细胞中UCA1 和转录因子cAMP 反应要素结合蛋白（cAMP response element binding，CREB）之间的联系提示，UCA1 通过PI3K-AKT 途径激活CREB 影响细胞周期调控［24］。

3.5 蛋白二硫化物异构酶家族A成员3假基因1

蛋白二硫化物异构酶家族A成员3假基因1（protein disulfide isomerase 3 peudogene 1，PDIA3P1）为一种符合lncRNA特征的假基因，位于染色体1q21.1，长度为2 099 bp。Sun等［25］研究发现，PDIA3P1在口腔鳞状上皮癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中过度表达和该类肿瘤的预后相关，通过siRNA抑制细胞周期素2（cyclin D2，CCND2）蛋白沉默该基因后可以减少Ki-67抗原的增殖表达，抑制肿瘤生长。PDIA3P1通过抑制siRNA负性调节miRNA-185-5p，但对信使RNA（messenger RNA，mRNA）水平无影响。Reece等［26］研究提示，部分lncRNA在转录水平和转录后水平调节基因均表达，作用于肿瘤发展调节因子，如CCCTC结合因子、c-myc和p53等。PDIA3P1在MM中也存在过表达，与MM的生存率呈正相关。PDIA3P1通过葡萄糖6-磷酸脱氢酶（Glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD）和磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）调节MM的生长与耐药，且与c-myc相互作用增强其反式激活并结合于G6PD增强子，导致G6PD 过表达以及PPP 活化［27］。因此，PDIA3P1可以作为MM诊治的潜在新靶点。

3.6 p53调节相关lncR NA

约11%MM中的染色体类型为del（17p），相对应的基因学异常为抑癌基因p53 缺失［26］。p53 调节相关lncRNA（p53 regulation associated lncRNA，PRAL）位于17p13.1，与p53的表达密切相关［28］。Avet-Loiseau等［29］研究表明，PRAL与MM的疾病进展和预后相关，发现PRAL在原发性MM细胞表达下调，在del（17p）的情况下更为显著，并与MM 的国际分期系统（international staging system，ISS）分期和D-S（Durie-Salmon）分期相关。低PRAL患者无病生存期（disease free survival，DFS）和OS均降低，为DFS和OS的独立预测因素。体外实验证实，PRAL3增强硼替佐米（bortezomib，BTZ）的抗MM作用。miRNA-210为PRAL的靶点，miRNA-210过表达降低了PRAL对BTZ的作用。骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）为miRNA-210的靶点，PRAL通过吸附在miRNA-20上不降低对BMP2的抑制作用。对于MM伴有del（17p）的患者，PRAL可能成为新型的，对MM的诊治和预后具有重要价值的lncRNA［30］。

3.7 OPA作用蛋白5反义转录本1

lncRNA OPA 作用蛋白5 反义转录本1（OPA-interacting protein 5 antisense transcript 1，OIP5-AS1）位于人染色体15q15.1，主要正性调节细胞周期G2/M期，在多种肿瘤中有促细胞增殖的作用［31］。有研究证实［32］，lncRNA OIP5-AS1在MM细胞表达下调，lncRNA OIP5-AS1与miRNA-410构成的信号轴可能在细胞分化过程中发挥负性作用，缺乏lncRNA OIP5-AS1会介导MM细胞中的miRNA-410积累，导致细胞增殖、细胞周期进展和凋亡抑制。Zhang等［33］研究发现，lncRNA OIP5-AS1在肝母细胞癌中的作用与在MM中相似，敲除OIP5-AS1后上调miRNA-186a-5p和下调转录因子锌指E盒结合同源盒1（zinc finger E box binding homeobox 1，ZEB1）抑制肝母细胞瘤的繁殖和转移，提示lncRNA OIP5-AS1具有高度致癌特性。

3.8 H19

lncRNA H19的作用首先在乳腺癌中提出，Sun等［34］在筛选与乳腺癌相关的lncRNA时发现，lncRNA H19在雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性的MCF-7乳腺癌细胞中高表达。敲低lncRNA H19降低了细胞的生存并且阻碍了雌激素介导的细胞增殖。Pan等［35］研究发现，lncRNA H19位于MM细胞的细胞质中，并通过体外动物实验证实，多数lncRNA H19可能通过ceRNA调节骨髓瘤细胞对BTZ的耐药过程。通过生物信息学进行推测，miRNA-29b-3p 可能为lncRNA H19 的靶向miRNA，其靶蛋白为骨髓瘤细胞白血病序列-1（myeloid cell leukemia sequence-1，MCL-1），MCL-1属于抗凋亡蛋白Bcl-2家族，通过蛋白酶体进行泛素化降解，在多种肿瘤中有表达。lncRNA H19在MM进展过程中可能起到癌基因的作用，过表达lncRNA H19可能显著增加肿瘤生长，抵消miRNA-29b的抗肿瘤作用。Corrado等［36］研究提出，lncRNA H19为不同的分子介导体，通过缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）的激活促进肿瘤细胞增殖、运动和转移。在缺氧（O2浓度为1%）MM细胞系中可以发现lncRNA H19过表达，MM发生扩散，与表达缺氧诱导基因C-X-C模序细胞因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）有关。此外，lncRNA H19减少缺氧条件下间充质细胞的黏附，蛋白印记实验表明lncRNA H19对受损的HIF-1α的核仁易位有沉默作用。由此可见，lncRNA H19在肿瘤增殖方面的多个机制上起到促进作用。

3.9 FEZ家族锌指蛋白1反义RNA1

FEZ 家族锌指蛋白1 反义RNA1（FEZ family zinc finger 1 antisense RNA 1，FEZF1-AS1）为一个与肿瘤不良预后相关的lncRNA，在视网膜神经胶质瘤中为一个上调的原癌基因，高水平的FEZF1-AS1 显著降低生存率，沉默FEZF1-AS1抑制该肿瘤的细胞增殖、侵袭和迁移［37］。在MM 中，FEZF1-AS1 显著下调，Li等［38］通过细胞系验证FEZF1-AS1 抑制MM 细胞的增殖，使细胞周期静止在G0/G1期，并在体外介导细胞凋亡。此外，该研究证实FEZF1-AS1 在MM 细胞中作为ceRNA抑制AKT3调节miRNA-610的表达。

3.10 浆细胞瘤易位转化物1

浆细胞瘤易位转化物1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）由位于myc基因的下游的PVT1基因编码，近年来大量研究表明PVT1在人类肿瘤中过表达。Yang等［39］通过qRT-PCR发现，PVT1在MM骨髓样本和细胞系中表达上调，miRNA-203a为下调，两者的表达具有相关性（P＜0.05）。体外功能实验发现，PVT1抑制MM细胞的繁殖并诱导MM细胞凋亡（P＜0.05），生物信息学方法预测PVT1对miRNA-203a起到分子海绵（ceRNA）作用，抑制其表达。PVT1/miRNA-203a轴为探讨MM致癌性的机制之一［39］。

3.11 NR_046683

lncRNA NR_046683 为通过高通量lncRNA 筛选确定的1 个lncRNA，除MM 外在其他肿瘤中暂无报道。Dong等［40］采用qRT-PCR对细胞系MM组和对照组进行检测，相关统计学分析发现，lncRNA NR_046683与MM的预后评价密切相关，同时在肿瘤细胞系KM3 和U366 中检测出来，特别是在耐药细胞系KM3/BTZ和MM1R中更为显著。lncRNA NR_046683在不同的MM 亚型和时期的表达存在明显差异。过度表达的lncRNA NR_046683与β-2微球蛋白的含量密切相关，而且发现该lncRNA 与染色体变异如del（13q14）、1q21+、t（4；14）易位相关。据此推断，lncRNA NR_046683 可以作为潜在的药物靶向型生物标记物和判断MM预后的新型分子。

4 展望

综上所述，lncRNA在MM的发生发展过程中发挥关键作用。不同的lncRNA所在的染色体部位不同，所起到的生物学作用差异性较大。本文列举了已发现的与MM相关的lncRNA，但仍有较多的lncRNA与MM的关系亟需得到阐释。此外，即使是功能上已有定论的lncRNA，可能在其他未知机制上也有不同的作用。lncRNA与上游分子mRNA、及下游分子miRNA的关系较为密切，形成了复杂的共表达网络，其关系和机制亟需进一步研究。lncRNA有望作为MM的特异性肿瘤标志分子和药物治疗靶点，期待未来通过lncRNA对MM的发病机制能有更新的认识。